细胞永生化实验

• EBV主要通过结合人类B淋巴细胞膜上的 EB病毒受体而感染B淋巴细胞，初次受到 感染便被迅速致敏，36h后就可有DNA 合成。被感染的B细胞在EB病毒核抗原的 刺激下转化为类淋巴母细胞，其端粒酶活 性提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳 定，并能够不断分裂增殖，从而促使B淋 巴细胞的永生性生长。转化的细胞株染色 体稳定，保留了原有的遗传性状。人淋巴 细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞遗 传和分子遗传研究的极好方法。
• Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先从 非洲恶性Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母细胞 系中发现的，属疱疹病毒科γ亚科。EBV 有一个与其他DNA病毒不同的特点，就是 它在体外对B细胞的感染可刺激细胞的持 续性生长并引起细胞的永生化，从而形成 淋巴母细胞样细胞系(1ymphoblastoid cell lines，LCLs) ,尤其对人二倍体淋巴细 胞转化效果极佳。
实验材料和方法
试剂 产生 EBV的 B95-8细胞株，RPMI1640培
养基，PBS缓冲液，胎牛血清，淋巴细 胞分离液，环孢霉素A，植物凝集素， 台盼蓝染液 标本的收集 取样：无菌、轻轻摇动使血液与肝素混匀 秦巴山区精神发育迟滞患者家系（两天 之内的血样）
实验方法
EB病毒的制备
• EB病毒基因组序列及其表达研究主要是 用B95-8 株进行的,B95-8 细胞系是用 传染性单核细胞增多症患者的EB 病毒感 染绒猴B 淋巴细胞建立的。在B95-8 细 胞系中只有很少一部分细胞可以自发产 生病毒, 其他细胞呈隐性状态, 用不同的 诱生剂如TPA诱生后, 使产生病毒的细胞 明显增加。B95-8在EB病毒转化B-淋巴 细胞过程中非常重要, 通过培养B95-8细 胞制备出大量高效价的EB病毒液, 对于 B95-8细胞的培养质量是EB病毒转化B淋巴细胞成败的关键。
• 复苏B95-8细胞株，加入无血清 RPMI-1640培养液，1000r/min离 心10min,弃上清，加入完全RPMI1640培养液(含10％FBS，含Pen／ Strep)，每2-3d半量加液一次，待细 胞数达到lxl06／mL时，饥饿细胞47d后，收集上清液，-70℃及37℃反 复冻融 3 次 ,再转移至离心管 中 ,2000r/min 离心 15min，将上 清液用 0.22 μm 滤膜过滤后分装至 1.5mlEpendof 管中 ,平均 1.2ml/ 管 ,-80 ℃ 保存。
• 此外,EBV 在体外对B细胞的转化效率 很高,一般都能达到80%-100%。因 为上述特点,世界上许多遗传研究中心 都用此方法作为常规处理每一份血标 本 ,建立人类遗传种质库。
• 病毒转化后的B淋巴母细胞样细胞系 (B-LCLs)依然保存了B细胞的分化特 征和免疫表型，作为抗原递呈细胞， 它可以摄取加工抗原，并将其载体部 分表达于细胞表面，供T细胞受体识 别；也可作为抗体基因的来源，将其 与骨髓瘤细胞融合，制备分泌相应的 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
• 为治疗肿瘤、 控制肿瘤细胞的增殖以 及器官移植的研究奠定了坚实的基础。
• 由于永生化细胞具有可以多次传代的 这一特性, 我们可以利用各种细胞永 生化的方法使那些传代困难、 增殖慢、 易衰老的细胞获得永生,从而提供更多 的细胞资源。
EB 病毒转化人类外毒 (epstein barr virus) 转化 外周血B 淋巴细胞(B-LC) , 使其成为一 种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞 ( lymphoblastoid) , 由此建立的类淋 巴母细胞株即为永生细胞株 ( immorta1ized cell lines) , 它可永 远传代, 并且每一种永生细胞株保存了 原来提供血样个体的完整基因组, 而且 它的生化和分子生物学特性不发生变化, 可作为生物标本库建立的首选方法。
淋巴细胞EBV转化法
（1）将血样静置30分钟，期间进行下一步实 验。
（2）冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分 离液。摇匀后在无菌状态下取4mL加入刻度 离心管中，37℃水浴中平衡。
（3）PBS缓冲液将血样1:1稀释混匀（各 3mL）。
（4）将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离 液液面上。
• 利用EB病毒转化外周血B-淋巴细胞建 立精神发育迟滞永生细胞库, 或各种疾 病, 特别是罕见疾病永生细胞库已成为 当今永久保存全基因组的首选方法, 它 可为精神发育迟滞及其它罕见疾病的遗 传流行病学、临床遗传学、分子生物学 等研究提供永久性试验材料。
• EB病毒的特征之一是对B细胞有天然的 亲和力并使其发生转化,EBV引起的是一 种无休止的细胞分裂和 DNA 的无限的 合成。
什么是细胞永生化？
• 细胞永生化是指体外培养的细胞经过 自发的或受外界因素的影响从增殖衰 老危机中逃离, 从而具有无限增殖能 力的过程。
• 正常细胞的增殖能力有限,经过一定时 间的增殖后, 最终会进入一种生长抑 制状态, 而一些肿瘤细胞可以无限增 殖。
细胞永生化意义
• 了解细胞增殖与衰老的分子机制及保 存一些重要疑难病例的样本。
正常细胞的寿命是有界限的， 体内细胞是这样，体外培养的细 胞也是如此。
细胞永生化实验则是针对体 外培养的细胞而建立的。
Hay flick界限
• Hay flick界限：体外培养的细胞，不是不死的， 而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是 有一定界限，这个界限称为Hay flick界限。
• 在体外培养的人正常细胞, 经一段时间的分裂, 就会进入一种生长抑制状态, 即衰老期( M1期)。 大多数真核生物细胞(生殖细胞、 干细胞除外) 都具有这种特性。 经转化了的细胞可越过衰老 期而进入另一增殖抑制状态,即危机期( M2期) , 危机期的细胞开始出现退化, 并逐渐死亡。 只 有少数细胞在一定因素的影响下, 端粒酶被激 活, 以自身RNA 为模板合成端粒DNA 来补充 或延长端粒,恢复染色体的稳定性,从而使细胞 越过危机期,发生了永生化。