蛋白质的测定PPT课件

杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮 气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。 测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
几种蛋白质测定方法比较
原理 装置 溶剂
时间 灵敏 度 干扰
凯式定氮法 双缩脲
总氮量
蛋白氮
凯式定氮装置 分光光度计
浓硫酸
用量较少
长
较低
简单快速 低
较小
▪ Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） ▪ N为稀释倍数 ▪ c为样品原浓度（mg/ml）。
福林-酚法（双缩脲法的发展）
▪ 两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋 白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
0.0 4.0
A540
取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋 白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0Байду номын сангаас
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
3、计算
▪ 取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
第四节 氨基酸定量测定
一、甲醛滴定法
氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后， 与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定 -COOH基。
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法
凯氏定氮法 杜马斯法 福林酚法 染色法
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
双缩脲试剂/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
5 1.0 10.0
蛋白质的测定
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23% ▪ H：6-8% S：0-4% ▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu 2、基本结构单位：氨基酸 3、蛋白质的变性作用。
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
第三节 蛋白质的定量测定 关于氮-蛋白质换算等数 6.25
= 6.25 = 6.38
5.95
=
一、凯氏定氮法
常量凯氏定氮法
1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白 质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出， 而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 ① 消化
有干扰
杜马斯
福林-酚
总氮量
蛋白氮
高温装置、GC 分光光度计
不需要
福林-酚试剂
3min 高
简单快速 高
较小
酸类及柠檬 酸类
其他方法
染色法 紫外 吸收法
水杨酸比色法
采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下 列记录的数据计算：
水份含量=8.0%，1 号样品重量=1.015g，2号样 品重量=1.025g，用于滴定的标准HCl浓度 =0.1142mol/L，1号样品所用的HCl溶液的毫升数 =22.0mL，2号样品的HCl溶液的毫升数=22.5mL， 空白的HCl溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干 基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有 17.5%的氮。
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至 微红色为终点
同时做空白
凯氏定氮仪
凯氏定氮仪
二、双缩脲法
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 △150~160℃ NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲
双缩脲能和硫酸铜的碱性 溶液生成紫紫色色络络和合物物。。
操作方法
计算
V V M C( ) K 100%
X=
1
2
N
W 1000
▪ X为样品中蛋白质的含量 ▪ V1为样品消耗盐酸标准液的体积 ▪ V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积 ▪ C为盐酸标准液的浓度 ▪ MN为氮的摩尔质量 ▪ W为样品的质量 ▪ K为氮换算为蛋白质的系数
微量凯氏定氮法 3.消化液 10mL
2NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点 <2>加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂
<3>加氧化剂 加速有机物氧化速度
② 蒸馏
NH4+ + OH== NH3 +H2O
影响氨化完全和速度的因素
▪ （1）K氏烧瓶和取样量 ▪ （2）分解剂
1g样品 K2SO4： H2SO4 = 7g : 12ml 还有一种比例： K2SO4： H2SO4 = 10g : 20ml
③ 吸收与滴定
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定
指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿）
指示剂 红色
绿色
红色
（酸）
（碱）
（酸）
反应式为： NH3+H3BO3==NH4++H2BO3<2> 用过量的H2HB2OSO3-+4 或H+H=C=lH标3B准O溶3 液吸收，再 用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管 尖端提离液面再蒸馏1min ，用 水冲洗管尖后停止蒸馏
现测定某一种食品的蛋白质的含量， 这种样品含有大大量量的的脂脂肪肪，样品经过处理 后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分 结合，经振振摇摇后大大火火加热进行消化；消化 22hh后后，，估计消消化化完完全全，取出消化液加入少少 量量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂 Na甲OH 基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对 吸收液进行滴定。