重组猪源抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的分泌表达与活性研究

抗 菌肽 （ ｅｒ ｐｎ 是 一类 被 称 为“ 二 防御 体 系 ” Ｃ ｃｏ ｉ） 第 的生 物 活性 小 肽 Ⅲ ， 有 广 谱 、 】具 ］ 高效 的 抑 菌 活性 ， 能攻
ＡＴＣ ５ ２ 标 准 株 ， Ｃ２ ９ ２ 自行保 存 ； ｉｈａｐ ｓ ｒｓＸ ３ 、 Ｐ ｃ ｉ ａ ｔ ‘ 一３ ｏｉ
０ ５ 甲醇 ，． Ａｇ ｒ ｄ Ｈ２ ． １５ ａ ，ｄ Ｏ。 １ ２ 试 剂 ． 限 制 性 内切 酶 Ｈｉ ｍ、 ｏ 、 ａ 、 ｖ 、 分 子 ｎａ Ｎｃ Ｓ ｃ Ａ ｒ１低 Ｉ Ｉ Ｉ
确 翻译 和 翻译 后加 工 ， 而且 能分 泌许 多 蛋 白质产 物 ， 使
生 物 素，
内二硫 键 ， 有强 碱 性 的 Ｎ一 和 强 疏 水 性 的 Ｃ 端 ， 一 端 ＿ ｃ 端
酰胺 化 。其 分 子 内含有 两 亲性 一 旋 ， 间 是形 成 柔 螺 中
ｔａｔ １ ３ ＹＮＢ， ×１ ｒｃ， ． ４ ４ ０
生 物素 ，． 甘 油 ， ０ ０５ １０
ｍｍｏ ・ 磷 酸钾缓 冲溶 液 （ Ｈ 值 ６ ０ 。 ｌ Ｌ ｐ ． ） Ｂ ＭＭＹ 培 养 基 ： Ｐ ｌｐ ｐｏ ｅ １ Ｙｅｓ ｘ ２ ｏｙ ｅ ｔｎ ， ａｔｅ ～
收 集 菌体 ， 上 清 ， 菌 体 重 悬 于 Ｂ 弃 将 ＭＭＹ 培养 基 中， 使 其 ｏＤ 。为 １ 然后继 续在 ３ 。 ， Ｏ℃摇 床 培养 ， 每隔 ２ ４ｈ
向Ｂ ＭＭＹ培 养基 中加 入 甲醇至 终浓 度为 ０ ５ ， 按 ． 并
照 ２ 、６ｈ ４ 、 ０ｈ ７ 、４ ｈ ９ 、 ２ ４ｈ ３ 、８ｈ ６ 、 ２ｈ ８ 、 ６ｈ １ ０ｈ时 间
游 引 物进行 鉴定 。 １ ３ ４ 阳性 菌 株 的诱 导 表达 ． ．
赤 酵母 偏好 性 密码 子设 计 编码 基 因 ， 在 其 两 端 添 加 并
表 达 载 体 的 同源 序 列 ， 用 重 叠 区 基 因 扩 增 拼 接 法 利 （ ｏ — Ｃ 合成 目的片段 后 ， 过 Ｆ ｓ ｓａ ｅｓｃｏ Ｓ Ｅ Ｐ Ｒ） 通 ａｔ ｅｍｌｓ ｌ－
重 组质 粒 经酶 切和 Ｐ Ｒ鉴 定 ， 对其 测序 。 Ｃ 并 １ ３ ２ 重 组质 粒转 化毕 赤酵母 及 表型 筛选 ．． 将 毕赤 酵母 菌 Ｘ ３ 一３制 备成 感 受 态 。取 １ １ ｇ ～ ｏ 的Ｓｃ ａ Ｉ或 Ａｖ Ｕ线性 化 的重 组 质 粒 ， 别 与 １ ０ Ｌ ｒ 分 ０
Ｂ ａ ｆｒ 法 ［３ 测蛋 白总 含量 。 ｒｄｏ ｄ １ 检 １ １ ３ ６ 生 物活 性检 测 ．．
取 ｐ Ｉ Ｚ Ｂ重组菌落 划线于 ＭＭ 和 ＭＤ选 择培养 基平 ＰＣ ａ 板上， ３ 于 ０℃培养 ２ ， 过观察生长速 度鉴定其 表 ～３ｄ 通 型 。ｐ Ｉ Ｚ Ｂ重组 质粒在 ＭＭ 和 ＭＤ 两种 平板 中都 能 ＰＣ ａ
其 编 码 基 因 ， 别 栽入 分 泌 型 表 达 栽 体 ｐ ＩＺ Ｂ和 ｐ ＡＰ ａ 中 ， 切 线 性 化 后 电 穿 孔 导 入 酵 母 细 胞 进 行 整 合 ， 高拷 分 ＰＣ ￣ Ｇ ＺＡ 酶 经
贝整 合 子 筛 选 以 及 表 型 筛选 获 得 高 效表 达 抗 茵 肽 的重 组 菌株 ， 培 养 条 件 优 化 确 定 摇瓶 发 酵 抗 茵 肽 的 最佳 收 获 时 间 ， 经 据
ｎｎ ｉｇ重 组 技术 ， 别 在 大 肠 杆 菌 ＴＯＰ ０中构 建 得 ］分 １
到以 ｐ ＩＺＢ ｐ Ｐ Ｃ ａ ／ ＧＡＰ ａ 为载体 的 Ｃ ｃｏ ｉ １ 因 ＺＡ ｅｒ ｐｎＰ 基 Ｃ 端 干 净 以 及 Ｃ 端 融 合 ６ Ｈｉ Ｔａ 一 一 ｘ ｓ ｇ的 不 同 表 达 盒 。 －
点严 格 取 样 １ ｍＬ， 上 清 于 一 ８ ℃ 保 存 ； 于 取 Ｏ 对
ｐ ＧＡＰ ￣ Ｚ Ａ构 建 所 得 的 阳性 转 化 子 ， 则接 种 到 １ ５ ｍＬ
酵母 感 受态 细 胞 混 合 ， １ ５ｋ ２ Ｆ ２ ０Ｑ 条 件 在 ． Ｖ、 ５ 、 ０
下 电击 转化 ， 后立 即加 入 １ｍＬ预 冷 的 １ｔｏ ・Ｌ 然 ｌ ｏ
性 弯 曲 的谷 氨 酸 一甘氨 酸 （ ｕＧｌ） 曲序 列¨ ， Ｇｌ— ｙ 卷 ４ 这一 ］
特征 结 构对 其保 持 高抗 菌 活性具 有 特殊 的重 要性 。
原 核 表达 系统 所表 达 的外 源蛋 白难 以进 行 翻译后 的修 饰 加工 ， 融合 表达 的后处 理麻 烦 ， 且 不适 宜 大规模 生产 ； 而毕 赤酵 母 表达 系统 不 仅 能 使 外 源 真 核 基 因 正
ＹＰ 培养 基 （ Ｄ 山梨 醇 选择 培养 基 ） ２ Ｐ ｌｐ ｐ ： ｏｙ ｅ —
ｔｎ ， ｏ ｅ １ Ｙｅｓ ｘｒｃ ， Ｉ 葡萄 糖 。 ａｔ ｔａ ｔ２ ） ｅ ＿
Ｂ ＭＧＹ 培 养 基 ： Ｐ ｌｐ ｐｏ ｅ １ Ｙｅｓ Ｃ — ２ ｏｙ ｅ ｔｎ ， ａ ｔ Ｘ
真核 表 达 载 体 ｐ Ｉ Ｚ Ｂ和 ｐ ＰＣ ａ ＧＡＰ ａ 美 国 Ｉｖｔｏ Ｚ Ａ， ｎｉ — ｒ
ｇ ｎ公 司 。 ｅ
击癌 细 胞而 不破 坏 正常 细胞 ， 能促 进伤 口愈合口 ， 还 ］ 可
开发 成 具有 一定 应用 价 值 的食 品添 加剂 和药 物 。 猪 源 抗 菌 肽 Ｃ ｃｏ ｉ １３含 有 ３ ｅｒ ｐｎ Ｐ Ⅲ １个 氨 基 酸 残 基 ， 子量 为 ３ ３ ． ７Ｄａ 不含 半 胱 氨 酸 ， 形 成分 子 分 ３ ７ ８ ， 不
１ 实 验
１ １ 菌株 、 粒 与培 养基 ． 质 大 肠 杆 菌 （ ｃ ｅｉｈａ ｃ ｌ ）Ｔ １ 、指 示 菌 Ｅｓｈ ｒｃ ｉ ｏｉ ＯＰ ０
Hale Waihona Puke 限公 司 ； 其余试 剂均 为国产或进 口分析纯 。
１ ３ 方 法 ．
１ ３ １ 分 泌表 达 载体 的构 建 ．．
收 稿 日期 ： ０ １ ５ ６ ２ １ 一Ｏ 一Ｏ
挑 取经 Ｐ Ｒ鉴 定 为 阳性 的 Ｍｕ 表 型 高 拷 贝转 Ｃ ｔ
化 子 于 ２ ５ ｍＬ 的 Ｂ ＭＧＹ 培 养 基 中 ， Ｏ℃ 、 ５ ３ ２ ０ ｒ・ ａｎ ｒｉ 培养至 ０ ｏ ５ ８ ０ ａｉ 离 心 １ ｉ ， Ｄ６ 为 ， ０ ０ ｒ・ｒ ｎ ０ ０ ｒ ｎ ａ
ｔａｔ １ ３ ＹＮＢ， ×１ ｒｃ， ． ４ ４ ０
生 物素 ，． 甲醇 ， ０ ０５ １０
ｍｍｏ ・ 磷 酸钾 缓 冲溶液 （ Ｈ 值 ６ ０ 。 ｌ Ｌ ｐ ． ） ＭＤ培养 基 ：． ４ ＹＮＢ ４ ０ ９ 生 物 素 ， ％ １３ ， ×１ ／ ６ ２ 葡 萄糖 ， ． Ａｇ ｒ ｄ Ｈ Ｏ。 １５ ａ ，ｄ ＭＭ 培 养 基 ： ． ４ ＹＮＢ， １３ ４× １ ０
２１，ｏ ２ Ｎ ． ０１Ｖ１ ８ ｏ９亿 与 生 物 Ｚ 狸 ．
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅ ｇｉｅ ｒ ｇ ｅ ｓｒ ｏｎ ｎ ｅｉ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ５ ２ ． ０ １ ０ ． １ ｏ ： ０ ３ ６ ／． ｓ ｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． ９ Ｏ ７
蛋 白表达情 况 ［ １ 。 １ ３ ５ 重 组蛋 白的纯化 以及 蛋 白含量 测定 ．．
山梨 醇 ，Ｏ℃ 温育 １ ， １ ０肚 ３ ～２ｈ 取 ０ Ｌ涂 布 于含不 同浓 度 博莱 霉 素的 Ｙ Ｄ平板 上 ， ３ Ｐ 于 Ｏ℃倒置 培养 ３ ， ～６ｄ 直 到长 出菌 落 ， 选 出高 拷 贝 转 化 子 。 由于 ｐ Ｉ Ｚ Ｂ 筛 ＰＣ ａ
重 组 猪 源 抗 菌 肽 Ｃ ｃｏ ｉ １在 毕 赤 酵 母 中 的 ｅｒｐｎ Ｐ 分 泌 表 达 与 活 性 研 究
陈婉 娴 。 翟李 鹏 ， 叶 江 ， 惠展 张
（ 东理 工 大 学 生 物 反 应 器 工 程 国 家 重 点 实 验 室 ， 海 ２ ０ ３ ） 华 上 ０ ２ ７
摘 要 ： 构 建 活性 表 达 重 组 猪 源 抗 茵 肽 Ｃ ｃｏ ｉ １的 酵 母 基 因 工 程 菌 ， 用 重 叠 区基 因 扩 增 拼 接 法 设 计 并 合 成 为 ｅ ｒ ｐｎＰ 采
作 者简介 ： 陈婉 娴 （ ９ ４ ） 女 ， 建 人 ， 士 研 究 生 ， 要 研 究 方 向 ： 茵 肽 的 表 达 ， － ｉ Ｃ Ｘ ｒ＠ １６ ｃ ｍ； 讯 作 者 ： 惠 展 １８ 一 ， 福 硕 主 抗 Ｅ ｍａｌ Ｗ ．ｙ ２ ．ｏ 通 ： 张
教 授 ， 士 生 导 师 ， — ｉ ｈ ｉ ｚ ＠ ｅ ｕ ｔｅ ｕ ｃ 。 博 Ｅ ｍａ ： ｕｚ ｈ ｃ ｓ． ｄ ． ｎ ｌ ｈ
活性 测 定 的 结 果 获 得 能表 达 有 活性 抗 茵 肽 的 重 组 茵 ， 饲 用 抗 茵肽 Ｃ ｃｏ ｉ Ｐ 为 ｅｒｐｎ １生 产 工 艺 的建 立奠 定 了基 础 。
关 键 词 ： 菌肽 ； 赤 酵母 ； 瓶 发 酵 ； 性 检 测 抗 毕 摇 活 中图分类号 ： ５６ Ｑ １ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ４ ５ ２ ｌ ） ９ ０ ２ ５ ｌ ７ —５ ２ （ Ｏ １ ０ ～０ ６ —０
ｐ ＡＰ ａ Ｇ Ｚ Ａ为 载体 ， 旨在 构 建 高效 表 达 活 性 重 组 抗 菌
肽 Ｃ ｃｏ ｉ Ｐ ｅ ｒｐｎ １的 酵 母 基 因 工 程 菌 。
山梨 醇 、 物素 ， Ｘ Ｏ 生 Ｏ Ｉ Ｄ公 司 ； 博莱 霉 素 （ ｅｃ 下 ） Ｉ— Ｚ ｏｉ Ｍ ， ｎ ｎ
ｖ ｏｅ 公 司 ； ｉ ｇｎ ｖ 质粒 小 量抽 提 Ｋ ｔ上 海捷 瑞 生 物 科 技有 ｉ ，
的 ＹＰ 培 养 基 中 ， ０ ℃ 、 ５ ａｉ 摇 床 培 养 过 Ｄ ３ ２ ０ ｒ・ｒ ｎ
夜 ， ０ ２ｍＬ培养 液接种 于 １ ０ｍＬ ＹＰ 取 ． ０ Ｄ培 养基 中 ， 继续 在 ３ Ｏ℃摇 床 培养 ， 同样 按照 以上 时间 点取样 。 所得 发酵 液上 清 用 Ｄ － Ａ 法 ［ 进 行 沉 淀 ， ＯＣ ＴＣ ９ 待 样 品大约 浓缩 ６ 倍 之 后 ， Ｔ ｉ ｎ— Ｄ － ＡＧＥ检测 ６ 以 ｒ ｉｅＳ Ｓ Ｐ ｃ
陈 婉 娴 等 ： 组 猪 源 抗 菌 肽 ｃ ｃｏ ｉ １ 毕 赤 酵 母 中的 分 泌 表 达 与 活 性 研 究／ ｏ １ 一 ９期 — ——— —— —— —— —— — 重 ｅｒｐｎＰ 在 ２１ 年
根据 已发 表 的 Ｃ ｃｏ ｉ １氨 基 酸 序 列 ， 用 毕 ｅ ｒｐｎ Ｐ 选
为 表 达 系 统 ，以 分 泌 型 穿 梭 质 粒 ｐ Ｉ Ｚ Ｂ 和 ＰＣ ａ
量 Ｐ ｏｅ ｒｅ， ａ Ｒ ｒｔｉ Ｍａｋｒ Ｔ Ｋａ ａ公 司 ； 低 分 子 量 Ｐ ｏｅ ｎ 超 ｒｔｉ ｎ
Ｍ ａｋ ｒ Ｂ ｏＲａ ｒ ｅ ， ｉ－ ｄ公 司 ； ｏｙ ｅ ｔｎ 、 ａｔｅ ｔａ ｔ ＹＮＢ、 Ｐ ｌｐ ｐ ｏ ｅ Ｙｅ ｓ ｘｒ ｃ、
产 物 易 于 提纯 ［ ， ＝ 同时 由于其 表 达 水 平 高 、 作 简单 、 ５ ］ 操
成 本 低 廉 ， 适 合 于 小 分 子 抗 菌 多 肽 生 产 工 艺 的研 更 发 。因此 ， 者 选 择 毕 赤 酵 母 （ ｃ ｉ ａ ｔｒｓ 作 ］ 作 Ｐｉ ａ ｐ ｓ ｉ） ｈ ｏ
为 甲醇 利 用 型 质 粒 ， 合 到 酵母 基 因组 后 的表 达 需 整
Ｐ 介 导 ， 此 需 筛 选 出 甲 醇 利 用 正 常 型 转 化 子 因 Ｍｕ 。而 ｐ ＡＰ ａ 为 组 成 型 质 粒 ， 需 此 步 骤 。挑 ｔ Ｇ ＺＡ 无
‘
采 用镍 柱 亲 和层 析 法 ［ 】 重 组 蛋 白进 行 纯 化 ， 对