色谱检测

紫外-可见光分光光度计

分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准图谱对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。

紫外分光光度计和可见光分光光度计主要区别：波长范围不同，紫外200-400nm，可见光400-760nm，检测时更换光源。紫外用氢灯，可见光用钨灯。

紫外-可见光分光光度计的组成：

光源（紫外，氢灯；可见光，钨灯）、单色器（棱镜）、吸收池（玻璃、石英）、测量仪表（微电流计）。

操作方法:

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至“1”档。

3.根据所需波长转动波长选择钮。

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

PS-122可见光分光光度计：

1.采用的先进的微机处理技术，自动调0%，调100%，无误差T/A转换，浓度直读功能。

2.采用1200条/mm高性能光栅、波长精度高、单色性好，杂散光低。

3.采用进口的钨灯，发光效率更高，使用寿命更长，功耗也更低。

4．特有的4nm带宽、与同类可见光仪器相比，测试性能更佳。

5．超大的样品室，可选购放置100mm比色皿。

6．提供RS232接口，可连接计算机或者直接连接打印机。

薄层色谱

薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固—液吸附色谱。

色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱方法。由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（R f）。

吸附薄层色谱：是利用固体吸附剂对混合物中的各组分的吸附能力不同而使其分离的一种色谱方法。

制板：将吸附剂（氧化铝、硅胶、聚酰胺）涂布于平板上，形成薄层。

上样：将欲分离的样品液滴到平板上。

展开：将样品中各组分展开。

显色：最后是显色。

1.制板

（1）载体板的选择：最常用的是玻璃板。

（2）平面形状和大小：常用正方形或长方形。分析(20×20、10×20)cm2；预试（2.6×7.6）cm2，制备（20×40、20×100）cm2。

（3）薄层的涂布

干板：将固定相细粉直接均匀分布于平板上，多用于氧化铝薄层。

湿板：固定相+粘合剂+水，制成匀浆，倾注于板上，形成薄层，可用于硅胶、

聚酰胺、氧化铝薄层，最常用的是硅胶。（常用的粘合剂有煅石膏、淀粉、羧

甲基纤维素CMC）。

①硅胶G板：用硅胶G（硅胶+硫酸钙）和蒸馏水1:(3-4)的比例，在研钵或

烧杯中调成糊状。

②硅胶-CMC板：用硅胶H(硅胶+羧甲基纤维素)和0.3℅-0.5℅CMC的水溶液

以1:(3-4)的比例调成糊状。

固定相的分布：倾注操作、浸渍操作、涂布操作、喷雾操作。

（4）薄层的干燥：先将潮湿的薄层板在空气中晾干，然后入烘箱中干燥。（如硅胶或氧化铝板经120℃加热30min以上，得到具有活性的板。活化后的板存放在

密闭容器中。）

2.上样

以检测镇痛片(APC)的成分为例，成分有阿司匹林、咖啡因、非那西丁。

（1）准备标准液：分别准备阿司匹林、咖啡因、非那西丁溶液作为标准液。

（2）准备分离液：研碎→放入玻璃滴管中→加入乙醇→接收流出液

（3）点样：准备3块干燥的活性板，具边缘1.5-2cm出划线，在线上点样，左边点标准液，右边点分离液，点样直径不大于3mm,两点之间距离0.5-1cm。

3.展开

（1）色谱缸中倒入适量的展开剂（本实验无水乙醇/二氯甲烷/冰醋酸＝5ml:2ml:7滴）（2）将薄层板点有样品的一端浸入展开剂。

（3）当展开剂迁移一定距离后，取出薄层板。

4.定位和显色

（1）直接显色：有色物质

（2）荧光定位：紫外光灯下观察

（3）显色剂定位：碘、碱性高锰酸钾、铁氰化钾-三氯化铁、浓硫酸-甲醇、荧光显色剂。

（4）直接微量升华定位

（5）生物试验定位

5.计算R f值

气相色谱

一、气相色谱的概念

气相色谱是以气体做流动相的色谱分离装置，他的分离机理也是基于物质在流动相和固定相两相间分配的不同而导致分离。

二、工作原理

待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。

三、气相色谱仪的组成

气相色谱仪由以下五大系统组成：气路系统、进样系统、色谱分离系统、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；分离后组分能否鉴定出来则在于检测器，所以分离系统和检测系统是仪器的核心。

1.载气

气相色谱所用的流动相-气体叫载气。常用的载气有氮气（N2，纯度为99.9995%），来自钢瓶或氮气发生器，由分离空气来制得；氢气（H2 ， 99.99~99.9999%），来自钢瓶或氢气发生器（电解KOH或NaOH溶液得到）；氦气 (He) 装有钢瓶；另外还有氩气（Ar）,甲烷，乙烷和二氧化碳等。

2. 色谱柱

色谱柱是气相色谱仪中分离的心脏，色谱柱的选择是确定色谱分析方法的中心环节；要求色谱柱：效能高，选择性好，快速（几秒钟至几十分钟）。色谱柱包括填充柱和毛细管柱。选择色谱柱也就是选择固定相，固定相指柱中的内容物。

3.固定相

固定液的选择：

1）按“相似相溶”原则：极性相似或官能团相似

2）按组分性质主要差别：

沸点相差大的选非极性固定液

沸点相差小的选极性固定液

3）柱温 < 固定液最高使用温度——防止固定液流失