固定化酶技术

固定化酶在食品中的运用

摘要:固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术，目前已得到长足的发展。介绍了固定化酶制备的传统方法以及一些新方法，同时对酶在一些性能优良的载体上的固定进行了综述。

关键词：固定化酶；制备；载体

酶是由活细胞产生的一类特殊的蛋白质催化剂(核酶除外)，具有催化效率高、底物高度专一、反应条件温和、反应容易控制等特点。酶的最大缺点是其不稳定性，在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性，活性降低或丧失；而且酶反应后，会在溶液中残留，造成酶反应难以连续化、自动化，同时也不利于终产品的分离提纯，这些都大大阻碍了酶工业的发展，所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多，其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联，酶被限定在一定区域内，但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的，而经过固定化以后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶。固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。本文介绍了固定化酶的制备方法和优缺点，对其在食品行业中的应用情况进行总结，最后对其应用前景进行展望。

1固定化酶的制定方法[1-5]

1.1吸附法

吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。

物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。

离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。载体包含阴离子交换剂(如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等)和阳离子交换剂(如CM-纤维素、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、

IR-200、XE-97、Dowex-50等)两大类。

1.2包埋法

包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体；另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。

网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。

1.3共价结合法

共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。载体共价结合又可分为两种：一种是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。

非载体共价结合又叫交联法，是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、N，N’-乙烯双马来亚胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。

1.4结晶法

结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。

1.5分散法

分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好的话，会引起传质现象，导致酶活力降低。

1.6热处理法

热处理法是将含酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。热处理法只适合热稳定性较好的酶。在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。

1.7 其它方法

1.7.1纳米技术处理

即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。

1.7.2超声波处理

利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。

1.7.3 磁处理

磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物)，而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。

1.7.4 电处理

电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。

1.7.5辐射处理

γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。CO60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。