水溶性CdTePCdS量子点荧光探针同步荧光法测定DNA

第52卷第2期　2006年4月

武汉大学学报(理学版)

J.W uhan Univ.(N at.Sci.Ed.)V ol.52N o.2　

A p r.2006,129～132

收稿日期:2005209222 通讯联系人　E 2mail :cai _lin @w

基金项目:国家自然科学基金资助项目(20275027);湖北省教育厅科学技术研究重点项目(D 200524005)作者简介:徐　靖(19662),女,博士生,郧阳医学院副教授,现从事动态分子光谱及动力学分析的研究.　E 2mail :x uj ingw h @

文章编号:167128836(2006)022*******

水溶性CdT ePCdS 量子点荧光探针

同步荧光法测定D NA

徐　靖1,2,赵应声1,吴新国1,蔡汝秀1

(1.武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072;2.郧阳医学院公共与管理学院,湖北十堰442000)

摘　要:以巯基丙酸(HS —CH 2CH 2COO H )为稳定剂,水相合成了核壳型Cd TePCdS 量子点(QDs ).当固定波长差为240nm 时,Cd TePCdS 量子点的同步荧光最大发射位于338nm.基于DNA 对量子点荧光的猝灭效应,将

Cd TePCdS 量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA 的同步荧光分析法.详细研究了p H 值、量子点浓

度、离子强度、温度等条件对量子点同步荧光及DNA 测定的影响.该方法测定ctDNA 的线性范围为50.0～750.0μg/L ,检出限为16μg/L ,9次重复测定500μg/L ctDNA 的相对标准偏差为2.0%.该方法用于合成样品的测定,结果满意.

关　键　词:Cd TePCdS ;核壳型量子点;DNA ;荧光探针;同步荧光中图分类号:O 657.32 文献标识码:A

近年来,半导体量子点(QDs )的研究引起了广

泛的关注[1～4].半导体量子点的激发光谱宽,呈连续分布,发射光谱对称且半峰宽窄,不同大小的半导体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧光.这就使得在复杂体系中同时研究多种生物分子成为可能.与传统的有机荧光染料相比,半导体量子点还具有不易发生光漂白,荧光量子产率高及斯托克斯位移大等优点,因此可望作为荧光探针应用于生物体系中[2～5].水相合成的半导体量子点由于具有良好的亲水性和生物相容性,其合成及应用成为极具吸引力的研究新热点[6～8].

核酸作为遗传信息的载体,一直是化学和生命科学中重要的研究领域.核酸的定量分析是核酸研究的基础.荧光分析法因其简便快速、灵敏度高,成为核酸分析的最重要手段之一[9,10].由于核酸无内源荧光,故其测定必须应用量子产率高的荧光探针.核酸分子的检测灵敏度主要取决于核酸探针的检测灵敏度.某些能与核酸发生某种嵌插作用的有机染料如二苯并咪唑、溴化乙啶及其二聚体[10]等常用作核酸荧光探针.但是有机荧光染料易于发生光漂白现象,而使其信号强度减弱,从而限制了在痕量核酸检测中的应用.本文以巯基丙酸(HS —C H 2C H 2

COO H )为稳定剂,水相合成了核壳型Cd TePCdS

量子点.核壳体系可以有效地钝化核微粒表面的非

辐射复合中心,减少核心半导体在导带的捕获态,从而显著提高荧光量子产率,增强光稳定性[11,12].由于在量子点的外面包覆了一层巯基丙酸,借助于其外端的羧基,能与生物分子的氨基相作用,从而达到直接与生物分子结合的目的[6,7].Cd TePCdS 量子点具有宽而连续的激发光谱和狭窄对称的发射光谱,最大发射波长位于578nm.当固定波长差为240nm 时,其同步荧光最大发射位于338nm.与荧光发射光谱相比,该量子点的同步荧光光谱的峰形更窄,更对称,荧光强度也更强,与DNA 作用后量子点的同步荧光强度显著降低.基于DNA 对量子点荧光的猝灭效应,将Cd TePCdS 量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA 的等波长差同步荧光分析法,并对量子点与DNA 之间的结合方式进行了初步讨论.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器

小牛胸腺DNA (ctDNA )为华美公司产品,贮备

武汉大学学报(理学版)第52卷

液用p H7.4Tris2HCl缓冲溶液(含0.1mmol/L ED TA)配制,4℃贮存.实验用水为去离子二次蒸馏水,其他试剂均为分析纯.

L S55型荧光光谱仪(美国,PE公司),TB285型恒温水浴(日本,Simadzu公司),p HS23C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂).

1.2　实验方法

1.2.1　Cd TePCdS核壳型量子点的制备

参照文献[8],合成了水溶性Cd TePCdS核壳型量子点,并用元素分析、IR(红外)光谱、TEM(透射电镜)进行表征.

1.2.2　荧光测定

在10mL比色管中依次加入10μL0.1mol/L Cd TePCdS量子点溶液,不同浓度的ctDNA溶液,用0.05mol/L Tris2HCl缓冲溶液定容,于20℃水浴中温育20min,在Δλ=240nm时,同步扫描激发和发射单色器,记录338nm波长下QDs的同步荧光强度.

2　结果与讨论

2.1　反应体系的光谱性质

图1为Cd TePCdS量子点的发射光谱(曲线a)和Δλ=240nm时,体系中加入不同量ctDNA的情况下获得的同步荧光光谱(曲线b～d).F代表体系的荧光强度.由图1可知,Cd TePCdS量子点的最大发射波长位于569nm;Δλ=240nm时,同步荧光最大发射波长位于338nm.比较曲线a～d可以看出,同步荧光光谱的峰形更窄,更对称,荧光强度也更强,因此利用量子点的同步荧光测定的灵敏度和选择性更高.另外,由图1还可以看出,加入DNA 后

图1　Cd TePCdS QDs的荧光发射光谱(a)和不同ctDNA浓度下的同步荧光光谱图(b～d)　曲线b～d对应ctDNA的浓度分别为:0.00,0.10,0.30 mg/L;c(QDs)=5.0×10-4mol/L;p H7.40.05mol/L Tris2 HCl缓冲溶液,Δλ=240nm 同步荧光光谱形状不变而强度显著下降.进一步的实验表明荧光猝灭程度在一定范围内和DNA浓度成线性关系.基于DNA对量子点荧光的猝灭效应,本文将Cd TePCdS量子点作为荧光探针建立了一种简便快速测定DNA的同步荧光分析法.

2.2　测定条件的优化

对空白和加入ctDNA后的体系在不同的Δλ下进行同步扫描,实验结果表明,Δλ=240nm时Cd TePCdSQDs的同步荧光稳定,峰形对称且强度最大.

2.2.1　反应介质及p H值

试验了几种不同的缓冲体系如:0.05mol/L KH2PO42Na2H PO4,0.05mol/L柠檬酸2柠檬酸钠, 0.05mol/L Tris2HCl,以及不同p H值对测定的影响,发现只有在Tris2HCl介质中DNA浓度与QDs 的同步荧光强度猝灭有较好的线性关系.在p H6.5～9.1范围内研究了p H对测定的影响,结果如图2所示.其中,F0表示无DNA存在时体系的同步荧光强度).p H为7.4时,DNA对量子点同步荧光的猝灭效应最强,故测定时选用0.05mol/L p H7.4

的Tris2HCl缓冲溶液.

图2　p H值对体系荧光强度的影响

2.2.2　量子点浓度

Cd TePCdS量子点浓度c(QDs)(mol/L)以Cd Te分子的浓度计算,其对体系的荧光强度及DNA的荧光猝灭能力的影响如图3所示.随着QDs浓度增大,体系的荧光强度增强(曲线a),而DNA对QDs的荧光猝灭能力减弱(曲线b).考虑到灵敏度和信噪比,故选择2.0×10-4mol/L为最适宜的QDs浓度进行测定.

2.2.3　孵育温度和时间

孵育温度和时间对同步荧光强度的影响实验表明,Cd TePCdS量子点的同步荧光强度随温度升高而降低,在15～22℃之间,荧光强度较为稳定.在20℃水浴中孵育20min至38h同步荧光强度稳定

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