地中海贫血
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1、β 珠蛋白基因有多少个外显子？mRNA序列与 编码序列之间有何关系？ 1、每一编码球蛋白的基因均包含3个外显子、2个内 含子。（《地中海贫血的分子基础与常见的诊断方 法》，张 凝, 陈萍(审校) ,《内科》，2008年6月第 三卷。） 2、mRNA序列包含编码序列。（参考书籍：全国高 等学校教材生物化学第7版第二章第三节
理: DNA 限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸 序列, 得到一定长度的DNA片段, 而碱基的突变可导致酶切 位点的丢失或形成, 从而改变酶切片段的大小。突变基因在 经过相应的限制性内切酶水解后, 其电泳条带的数量和大小 就会发生改变, 根据这些改变可判断出突变是否存在。缺点: 由于单独使用该方法, 不能直接测出受试者突变基因的类型, 必须结合寡核苷酸探针等技术, 故其应用范围有一定限制, 且 操作繁琐。如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合 子, 无法用此方法进行产前诊断, 或者患儿和父母所有位点上 都是杂合状态, 只能进行50%的排除性诊断。 （《地中海贫血的分子基础与常见的诊断方法》，张 凝, 陈 萍(审校) ,《内科》，2008年6月第三卷。）
3 H bA、H bA2、HbF 测定 临床上常用醋酸纤维薄膜电泳 检测H b 各组份, 各种H b 在pH 8. 5 的缓冲液中均带负电荷, 在电场作用下向阳极泳动, 不同H b 等电点不同, 电泳速度不 同, 故在电泳图谱上呈现不同区带位置, 通过比较各区带染色 的强度计算HbA、H bA2、H bF 的含量, 对H b 的筛查有重 要价值 , 但陈旧H b 区带分散, 效果差, 易发生沉淀。高效液 相层析法测定H bF 和H bA2 克服了标本质量带来的影响, 准确度高, 重复性好, 不受高脂血液样本、黄疸标本的干扰, 且检测速度快, 对地中海贫血具有较好的初筛作用 。为了提 高检测灵敏度和特异性, 地中海贫血筛查通常将上述3 种方 法联合应用。MCV、红细胞渗透脆性试验及H b 电泳3 项平 行联合检测的灵敏度及特异度分别达100. 0%、79. 7%, 平 行联合检测的灵敏度与各单项检测灵敏度之间差异有统计学 意义( P< 0. 05) , 是地中海贫血诊断及其产前筛查中最理想 的试验方法。 （《地中海贫血的实验室诊断进展》代宏剑, 温柏平综述, 杨 俊逸审校 国际检验医学杂志2011年2月第32卷第2 期）
2、β-地中海贫血的分子基础是什么？中国人群中有哪五种 最常见的突变？这些突变对基因的表达有何影响？ 主要为转录突变，RNA加工突变，翻译的突变 β-地中海贫血的分子基础指引起β-地中海贫血发生的基因突 变及其分子表型（RNA表型和蛋白质型）的改变，突变的 类型以及基因型与表型的关系，从分子水平和基因水平上解 释β-地中海贫血的发病机制。突变主要分为两大类：一类是 非缺失型突变（包括点突变以及25bp以下的缺失或插入）， 另一类是缺失型突变（25bp至67kb的缺失）（《血红蛋白 与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主编， 广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
5、为什么患者HbA2增高？
5、β-地中海贫血病人的HbA2(α2 δ2)升高通常超过3.5%，
来自百度文库
而β地中海的重型与轻以及HbS,HbC和HbE等异常血红蛋白 的结合都会出现HbF的增高。HbA2的增高反应由于β-珠蛋 白基因失活导致δ-珠蛋白基因代偿性表达增加，而HbF的增 高剂反应由于β-珠蛋白基因失活导致γ-珠蛋白基因代偿性表 达增加。虽然这两种Hb在产生他们的合成会持续在一定的 低水平上，但他们的产量却不足以补偿β-地中海贫血中β-珠 蛋白链的降低，α-珠蛋白链仍然相对过量。β-地中海贫血时 HbA2和HbF2的增高归固于两个方面：1，对红母细胞前体 的选择，有利于产生更多的HbA2和HbF2；2.红母细胞的扩 增有利于γ-链和δ-链的产生。（《血红蛋白与血红蛋白病》 第二篇第十章，张俊武、龙桂芳主编，广西科学技术出版社）
2反向点杂交方法：与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本
原理相同, 所不同的是: 将膜上固定探针取代固定靶DNA, 经一次杂交就 可对未知样品中多个突变进行检测, 改变了传统杂交法一次只能检测一 种突变的方式 。
3等位基因特异性扩增技术( A lle le Spec ific PCR, AS-PCR)
非缺失型突变： ( 1) 转录突变。 ( 2) RNA 加工突变:1、剪切点突变；2、内含子通用序列的突变；3、内 含子序列的改变；4加工相关的编码区的改变。 ( 3) 翻译突变。 ( 4)显性遗传性β-地中海贫血导致的高度不稳定性血红蛋白。 ( 5)转录起始点突变。 ( 6)起始密码子突变。( 7) 3‘ 非翻译区突 变。 ( 8) PolyA(mRNA有聚腺苷酸)加合信号的突变。 （《血红蛋白与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主 编，广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
4、目前有哪些先进的诊断方法？
芯片毛细管电泳具有快速、方便、所需样本量少
等优点,将其用于产前诊断有望提高解决目前基因检 测速度慢、灵敏度低、检测所需样本量较多等问题, 为无创性产前诊断提供新的策略或手段。
(《芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血及无创性产前诊断的研 究》，胡华，《第三军医大学》， 2007年 )
五种最常见突变：
突变
人群 密码子71/72（+A） -28(A-G) 密码子17（A-T） 中国人 翻译突变 转录突变 翻译突变 12.4 11.6 10.5 38.6 15.7 β0 β+ β0 β0 β0
突变类型
频率
临床表现
密码子41/42(-CTTT) 翻译突变 内含子2-654 RNA加工突 变
新技术 1寡核苷酸探针：应用引物扩增珠蛋白基因, 同时合成与正常序列和突变
序列完全互补的寡核苷酸探针。将PCR 扩增产物点在尼龙膜上, 分别与 标记的正常和突变的ASO 探针杂交, 不完全互补的探针, 在一定条件下 可以完全洗脱, 再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位β-珠蛋白 基因正常, 仅与正常探针杂交,反之, 均带有突变时, 则仅与突变探针杂交。
原理: 针对β-地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物, 根据扩增得到的 电泳带判断是否存在对应的点突变, 结果清晰、准确可靠, 尤适用于小片 段DNA分析, 可作为快速检测携带者的筛查手段。
（《地中海贫血的分子基础与常见的诊断方法》，张 凝, 陈萍 (审校) ,《内科》，2008年6月第三卷。）
4限制性片段长度多态性连锁分析( RFLP连锁分析) 原
（《血红蛋白与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主编， 广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
3、如何检查β-地中海贫血？寡核苷酸探针杂交、反向点杂交、等位基因 特异聚合酶链反应，限制性内切酶分析检查方法的生化基础分别是什么？ 常规检查
1. 血常规测定地中海贫血的重要典型特征之一是小红细胞 和低色素, 因此最重要的血液学指标是血红蛋白含量、红细 胞计数和红细胞比容, 由此得出平均红细胞体积( MCV) 及 平均红细胞血红白含量( MCH ) 。若M CV 80 fL、MCH 25. 0 pg , 则可能为地中海贫血。血常规测定方法简单、自动化 程度高、普及率高, 可满足不同实验室的需要。缺点是不能 与缺铁性贫血鉴别。 2 红细胞渗透脆性试验������ 地中海贫血患者的红细胞膜存 在形态、生化、代谢异常,在低渗盐溶液中易膨胀破裂而溶 血, 该试验是地中海贫血群体筛查最简便的方法。 （《地中海贫血的实验室诊断进展》代宏剑, 温柏平综述, 杨俊逸审校 国际检验医学杂志2011年2月第32卷第2 期）
理: DNA 限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸 序列, 得到一定长度的DNA片段, 而碱基的突变可导致酶切 位点的丢失或形成, 从而改变酶切片段的大小。突变基因在 经过相应的限制性内切酶水解后, 其电泳条带的数量和大小 就会发生改变, 根据这些改变可判断出突变是否存在。缺点: 由于单独使用该方法, 不能直接测出受试者突变基因的类型, 必须结合寡核苷酸探针等技术, 故其应用范围有一定限制, 且 操作繁琐。如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合 子, 无法用此方法进行产前诊断, 或者患儿和父母所有位点上 都是杂合状态, 只能进行50%的排除性诊断。 （《地中海贫血的分子基础与常见的诊断方法》，张 凝, 陈 萍(审校) ,《内科》，2008年6月第三卷。）
3 H bA、H bA2、HbF 测定 临床上常用醋酸纤维薄膜电泳 检测H b 各组份, 各种H b 在pH 8. 5 的缓冲液中均带负电荷, 在电场作用下向阳极泳动, 不同H b 等电点不同, 电泳速度不 同, 故在电泳图谱上呈现不同区带位置, 通过比较各区带染色 的强度计算HbA、H bA2、H bF 的含量, 对H b 的筛查有重 要价值 , 但陈旧H b 区带分散, 效果差, 易发生沉淀。高效液 相层析法测定H bF 和H bA2 克服了标本质量带来的影响, 准确度高, 重复性好, 不受高脂血液样本、黄疸标本的干扰, 且检测速度快, 对地中海贫血具有较好的初筛作用 。为了提 高检测灵敏度和特异性, 地中海贫血筛查通常将上述3 种方 法联合应用。MCV、红细胞渗透脆性试验及H b 电泳3 项平 行联合检测的灵敏度及特异度分别达100. 0%、79. 7%, 平 行联合检测的灵敏度与各单项检测灵敏度之间差异有统计学 意义( P< 0. 05) , 是地中海贫血诊断及其产前筛查中最理想 的试验方法。 （《地中海贫血的实验室诊断进展》代宏剑, 温柏平综述, 杨 俊逸审校 国际检验医学杂志2011年2月第32卷第2 期）
2、β-地中海贫血的分子基础是什么？中国人群中有哪五种 最常见的突变？这些突变对基因的表达有何影响？ 主要为转录突变，RNA加工突变，翻译的突变 β-地中海贫血的分子基础指引起β-地中海贫血发生的基因突 变及其分子表型（RNA表型和蛋白质型）的改变，突变的 类型以及基因型与表型的关系，从分子水平和基因水平上解 释β-地中海贫血的发病机制。突变主要分为两大类：一类是 非缺失型突变（包括点突变以及25bp以下的缺失或插入）， 另一类是缺失型突变（25bp至67kb的缺失）（《血红蛋白 与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主编， 广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
5、为什么患者HbA2增高？
5、β-地中海贫血病人的HbA2(α2 δ2)升高通常超过3.5%，
来自百度文库
而β地中海的重型与轻以及HbS,HbC和HbE等异常血红蛋白 的结合都会出现HbF的增高。HbA2的增高反应由于β-珠蛋 白基因失活导致δ-珠蛋白基因代偿性表达增加，而HbF的增 高剂反应由于β-珠蛋白基因失活导致γ-珠蛋白基因代偿性表 达增加。虽然这两种Hb在产生他们的合成会持续在一定的 低水平上，但他们的产量却不足以补偿β-地中海贫血中β-珠 蛋白链的降低，α-珠蛋白链仍然相对过量。β-地中海贫血时 HbA2和HbF2的增高归固于两个方面：1，对红母细胞前体 的选择，有利于产生更多的HbA2和HbF2；2.红母细胞的扩 增有利于γ-链和δ-链的产生。（《血红蛋白与血红蛋白病》 第二篇第十章，张俊武、龙桂芳主编，广西科学技术出版社）
2反向点杂交方法：与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本
原理相同, 所不同的是: 将膜上固定探针取代固定靶DNA, 经一次杂交就 可对未知样品中多个突变进行检测, 改变了传统杂交法一次只能检测一 种突变的方式 。
3等位基因特异性扩增技术( A lle le Spec ific PCR, AS-PCR)
非缺失型突变： ( 1) 转录突变。 ( 2) RNA 加工突变:1、剪切点突变；2、内含子通用序列的突变；3、内 含子序列的改变；4加工相关的编码区的改变。 ( 3) 翻译突变。 ( 4)显性遗传性β-地中海贫血导致的高度不稳定性血红蛋白。 ( 5)转录起始点突变。 ( 6)起始密码子突变。( 7) 3‘ 非翻译区突 变。 ( 8) PolyA(mRNA有聚腺苷酸)加合信号的突变。 （《血红蛋白与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主 编，广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
4、目前有哪些先进的诊断方法？
芯片毛细管电泳具有快速、方便、所需样本量少
等优点,将其用于产前诊断有望提高解决目前基因检 测速度慢、灵敏度低、检测所需样本量较多等问题, 为无创性产前诊断提供新的策略或手段。
(《芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血及无创性产前诊断的研 究》，胡华，《第三军医大学》， 2007年 )
五种最常见突变：
突变
人群 密码子71/72（+A） -28(A-G) 密码子17（A-T） 中国人 翻译突变 转录突变 翻译突变 12.4 11.6 10.5 38.6 15.7 β0 β+ β0 β0 β0
突变类型
频率
临床表现
密码子41/42(-CTTT) 翻译突变 内含子2-654 RNA加工突 变
新技术 1寡核苷酸探针：应用引物扩增珠蛋白基因, 同时合成与正常序列和突变
序列完全互补的寡核苷酸探针。将PCR 扩增产物点在尼龙膜上, 分别与 标记的正常和突变的ASO 探针杂交, 不完全互补的探针, 在一定条件下 可以完全洗脱, 再从放射自显影观察杂交结果。如果两个等位β-珠蛋白 基因正常, 仅与正常探针杂交,反之, 均带有突变时, 则仅与突变探针杂交。
原理: 针对β-地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物, 根据扩增得到的 电泳带判断是否存在对应的点突变, 结果清晰、准确可靠, 尤适用于小片 段DNA分析, 可作为快速检测携带者的筛查手段。
（《地中海贫血的分子基础与常见的诊断方法》，张 凝, 陈萍 (审校) ,《内科》，2008年6月第三卷。）
4限制性片段长度多态性连锁分析( RFLP连锁分析) 原
（《血红蛋白与血红蛋白病》第二篇第十章第二节，张俊武、龙桂芳主编， 广西科学技术出版社，ISBN 7-80666-090-9/R.12）
3、如何检查β-地中海贫血？寡核苷酸探针杂交、反向点杂交、等位基因 特异聚合酶链反应，限制性内切酶分析检查方法的生化基础分别是什么？ 常规检查
1. 血常规测定地中海贫血的重要典型特征之一是小红细胞 和低色素, 因此最重要的血液学指标是血红蛋白含量、红细 胞计数和红细胞比容, 由此得出平均红细胞体积( MCV) 及 平均红细胞血红白含量( MCH ) 。若M CV 80 fL、MCH 25. 0 pg , 则可能为地中海贫血。血常规测定方法简单、自动化 程度高、普及率高, 可满足不同实验室的需要。缺点是不能 与缺铁性贫血鉴别。 2 红细胞渗透脆性试验������ 地中海贫血患者的红细胞膜存 在形态、生化、代谢异常,在低渗盐溶液中易膨胀破裂而溶 血, 该试验是地中海贫血群体筛查最简便的方法。 （《地中海贫血的实验室诊断进展》代宏剑, 温柏平综述, 杨俊逸审校 国际检验医学杂志2011年2月第32卷第2 期）