免疫细胞的分离技术2011

Innate immunity 固有免疫 定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得 的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作 用的免疫应答
组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NK细胞、单
核-吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、T 细胞、B1细胞）等 特点：先天具有、无潜伏期、无特异性、无记忆性 作用时间：0-96小时
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细
胞、树突状细胞、B细胞
其他细胞
自然杀伤 (NK) 细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中
性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞
肥大细胞
嗜酸性粒细胞
嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞
血小板
免疫细胞的特征
1、免疫细胞的形态学特征 理化性状
调节性T细胞Regulatory T cells，Tr
CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化
Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-作用下从Foxp3-T细胞分化。
（二）T淋巴细胞及其亚群的分离
玫瑰花结法（E花环沉降法）
尼龙毛柱分离法
淘洗法 免疫磁珠法 流式细胞术分选法
细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适
亲 和 板 分 离 淋 巴 细 胞 示 意 图
T淋巴细胞淘洗分离原理
• 利用T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固 相载体上的特异性单抗结合，将T细胞与其他细 胞分离的方法
方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微 镜下观察
玫瑰花结法
人T淋巴细胞表面表达CD2分子，即绵羊红细胞受体，
B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞
（SRBC）结合，形成玫瑰花结（rosette）,因为红细胞 环绕T细胞，形似花环，所以又称E-花环（E-rosette） 该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比 例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况
优点
• 简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用
• 可分离大量细胞
• 细胞不会被激活，可用于功能测定
缺点
• 纯度不高 • 耗时
淘洗法
也叫亲合板结合分离法 (immune panning isolation）。
利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于
塑料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的 特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则 与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的 细胞悬液中获取 同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具 有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗 原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除
人CD分组
分 组 黏附分子 CD（举例） CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18 (整合蛋白2) 、 CD29 (整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、 CD62E(E整合蛋白)、CD62L (L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、 CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM) 细胞因子/ CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、 趋化因子受体 CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、 CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4) 内皮细胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、 CD144(VE钙黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、 CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322) 碳水化合物结构 CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9) 树突状细胞 CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3) 、 CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4) 干细胞/祖细胞 CD133、CD243 基质细胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、 CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1) 红细胞 CD233CD242
第三节 免疫细胞的分离技术
一、
二、 三、
免疫细胞的种类与特征
免疫细胞的分离技术 免疫细胞分离的临床意义
免疫系统的组成
中枢: 胸腺、骨髓
免疫器官
周围：淋巴结、脾脏、粘膜 相关淋巴组织等 免疫系统 免疫细胞：淋巴细胞、单核-巨噬细胞 、 粒细胞、DC、肥大细胞、 NK细胞 免疫分子：抗体、补体、细胞因子、MHC、 TCR、粘附分子等
Adaptive immunity 获得性(适应性)免疫 定义：机体在生活过程中，因接触抗原性物质而获 得的免疫。T、B细胞识别病原体成分后产 生的免疫应答
特点：后天获得、有潜伏期、特异性，记忆性
参与细胞：T细胞和 B细胞
起作用时间：晚，一般在感染后4-5天发挥作用
一、免疫细胞的种类与特征
的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称为CD抗原
CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志
人CD分组
分 组 CD（举例） T细胞 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、 CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2) B细胞 CD19、CD20、CD21、 CD40、CD79a(Ig)、CD79b (Ig)、 CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、 CD269(BCMA)、CD307(IRTA2) 髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、 CD257(BAFF)、CD312(EMR2) 血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、 CD61 (整合蛋白3) 、CD62P(P选凝素) NK细胞 CD16 (FcRIII) 、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、 CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、 CD336(NKp44)、CD337(NKp30) 非谱系 CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、 CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、 CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、 CD305(LAIR-1)、 CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC)
未经抗原刺激的成熟T细胞，表达CD45RA
效应T细胞 effector T cells
表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应
记忆T细胞 memory T cells
表达CD45RO，介导再次免疫应答
T淋巴细胞亚群
• 表达TCR的类型分类 TCRαβ+ T细胞 TCRγδ+ T细胞
T淋巴细胞亚群
Ficoll 分 离 液 法 主 要 用 于 分 离 外 周 血 中 的 单 个 核 细
胞，是根据不同细胞密度不同的分离法
不同细胞密度不同
单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度
为1.077左右
人的红细胞密度为1.093，>1.077
粒细胞密度为1.092， >1.077
血小板密度 <1.077
辅助性T细胞 Helper T cells , Th
Th1: 细胞免疫
Th2：体液免疫
Th17：炎症反应
辅助性T细胞 Helper T cells , Th
TGF- +IL-6
辅助性T细胞 Helper T cells , Th
• 滤泡辅助性T细胞（T follicular helper， Tfh）通过细胞因子IL-10和IL-21来调节B 细胞的功能
方法
淋巴细胞 + SRBC悬液 → 37°C水浴 10 min →
低温低速离心 →
T细胞形成E花环而沉于管底 → 悬液中为B细胞。
尼龙毛柱分离法
混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、 浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附 于尼龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性， 这是获得富含T细胞群的有效方法
方法
肝素抗凝静脉血与等量Hank’s液或PBS混匀
沿管壁缓慢叠加于Ficoll分层液面上
水平离心2000 rpm × 20 min 离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞 洗涤细胞两次 RPMI1640重悬细胞 台盼兰染液混合计数 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色 活细胞数 活细胞百分率＝────── ×100％ 总细胞数
二、免疫细胞的分离技术
（一） （二） （三）
外周血单个核细胞分离 T淋巴细胞及其亚群的分离 B淋巴细胞及其亚群的分离
（四）
（五）
Mo/Mø 分离技术
NK细胞的分离技术
免疫细胞分离基本原理
不同细胞密度不同
不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
免疫细胞的分类
凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，通称为免疫细胞
（immunocyte），其中包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、 树突状细胞DC、肥大细胞、粒细胞等
根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类 免疫活性细胞(immunocompetent cells) 抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC) 其他细胞
免疫细胞的起源与分化
免疫活性细胞
具有特异性抗原受体、在接受抗原刺激下发生克隆性活化、 增 值 和 分 化 ， 产 生 适 应 性 免 疫 应 答 （ adaptive immune response)的细胞。这类细胞是机体产生特异性免疫应答的 基础，包括T细胞、B细胞
抗原提呈细胞 （antigen presenting cell, APC）
生物学特性
免疫细胞的特征
2、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原 指血细胞分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段以及细胞 活化过程中,出现或消失的细胞表面标记分子 聚 类 分 化 群 (分化抗原，cluster of differentiation ， CD)：应用单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
（一）外周血单个核细胞分离
外 周 血 单 个 核 细 胞 （ peripheral
胞 blood
mononuclear cells, PBMC ） 包 括 淋 巴 细 胞 和 单 核 细
• 是否表达CD4或CD8 CD4+ T细胞 CD8+ T细胞
T淋巴细胞亚群
• T细胞功能分类
辅助性T细胞 Helper T cells , Th 效应T细胞 Effector T cells , TE
ห้องสมุดไป่ตู้细胞毒T细胞 Cytotoxic T lymphocytes, CTL
迟发性变态反应T细胞Delayed T cells，Td 初始T细胞Naive T cells 调节性T细胞Regulatory T cells，Tr 记忆T细胞Memory T cells，Tm 抑制性T细胞Suppressor T cells，Ts
用本法分离PBMC，一般纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上
（二）T淋巴细胞及其亚群的分离
T淋巴细胞亚群
• T细胞的发育阶段分类 • 表达TCR的类型分类 • 是否表达CD4或CD8 • T细胞功能分类
T淋巴细胞亚群
• T细胞的发育阶段分类
初始T细胞 naive T cells