紫杉醇的提取工艺研究

紫杉醇提取纯化方法的研究进展

紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四

环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C

47H

51

NO

14

，分子量853.92。同

位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。

紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。

紫杉醇的抗癌机理

1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978

年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。Hela细胞在与紫杉醇共同温育20小时后被阻断在G2后期和M期。1979年Schiff等用浊度法进行了研究,发现紫杉醇能缩短微管在体外的聚合时间,使平衡向微管聚合方向移动,从而减小微管聚合临界浓度。在有GTP时,紫杉醇可以和PC-tubulin结合,计量比为1:1。他们还发现紫杉醇不影响纯化的Actin的聚合(紫杉醇20μM)。目前,有关紫杉醇的抗癌机理的研究仍是一个非常活跃的领域。最近的一些进展是Tatebe等发现紫杉醇能导致细胞凋亡;Kavallaris等首次报道了紫杉醇抑制卵巢上皮肿瘤与改变特定β-tubulin基因的表达有关;Vater等通过电镜和扫描力显微镜发现在Ca2+和紫杉醇存在下,微管蛋白的聚合发生畸变Dring等发现紫杉醇还可调节体内免疫功能，促进释放肿瘤坏死因子、白细胞介素、以及干扰素，对肿瘤细胞起抑制或杀伤作用。而且这种畸变结构随着加入紫杉醇和Ca2+的顺序不同而有所不同。

紫杉醇的来源

1963年美国化学家瓦尼(M·C·Wani)和沃尔(MonreE·Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中的短叶红豆杉树皮和木材中得到了紫杉醇的粗提物并发现其具有抗癌活性。但直到1969年,紫杉醇单体才被分离出来。此后,在红豆杉属的多种植物中均发现有紫杉醇存在。红豆杉属植物为红豆杉科常绿乔木或灌木,全世界共11种,分布于北半球的温带至亚热带地区,包括短叶红豆杉(Taxus brevifolia),欧洲红豆杉(T. baccata),云南红豆杉(T.yun-nanensis),中国红豆杉(T. chinensis)等。在欧洲,更为常见的是欧洲红豆杉(Taxus baccata),具有明显的毒性,常有牲畜和人误食中毒的事情发生,其毒性源于所含有的有毒生物碱紫杉碱(taxineA、B);因而后来有一个有趣的观点:如果当年在NCI抗癌活性成分筛选计划中沃尔和瓦尼拿到的是T.baccata而非T.brevifolia的树皮,要么会因萃取物的毒性而停止分离,要么只能得到紫杉碱,都不会有机会发现Taxol。幸运的是,美国农业部的收集计划中送来的唯一样品是T.brevifolia,而其中紫杉碱的含量极微,紫杉醇从而有幸成为30年来最为公众瞩目的植物来源的化合物。迄今为止,红豆杉属植物仍是紫杉醇的最重要的来源。除了可从其树皮和枝叶中直接分离得到紫杉醇外,其树叶中含量很高的10-去乙酰巴卡亭III也是人工半合成紫杉醇的原料。此外,紫杉醇还可以从全人工合成、真菌发酵、细胞培养及生物合成等途径获得。

紫杉醇提取工艺

随着人们对紫杉醇研究的不断深入和完善，化学合成、基因工程、细胞培养、真菌发酵等方法均可以成功获得紫杉醇，但这些方法应用于紫杉醇的生产依旧停留在实验室研究阶段。目前，国内外紫杉醇的商业化规模生产多以红豆杉植物为原料，通过一系列的分离纯化获得。针对红豆杉资源严重匾乏的现状，相关生产企业采用人工培植的方法经过科学合理的选种育种栽培，加大红豆杉植物的人工培植规模，为紫杉醇的生产提供相对充足的原料供给。在细胞组织培养和基因工程技术等方法应用到紫杉醇的工业化生产之前，植物提取法仍是紫杉醇的主要来源。因此，开发出一套操作简便、快速高效的紫杉醇提取分离纯化技术无疑对紫杉醇原料药的产业现状发挥积极作用。

紫杉醇的提取过程可分为粗提和纯化两个阶段。红豆杉植物经粉碎干燥等预处理后，进入紫杉醇的粗提工艺程序。粗提阶段的目的在于选择合适的提取溶剂，运用可行的提取手段对原料粉末进行提取处理，获得含目标产物的原料液，然后从原料液中尽可能多的提取目标产物，提高目标产物在物料中的含量，所得物料在进行后续纯化获得纯品。紫杉醇的粗提工艺过程可分为初级提取和次级提取，两个过程因所用溶剂不同而除去不同的杂质。

1、紫杉醇的初级提取工艺

初级提取主要是用甲醇、乙醇、乙酸乙酷一丙酮或二氯乙烷一水对原料粉末进行浸提，一般浸提时间较长。为了缩短浸提时间，研究人员将超声、微波和超临界流体萃取等技术引入到紫杉醇的初级萃取，极大提高了紫杉醇的萃取效率。

1.1溶剂浸提

溶剂浸提常用于紫杉醇的粗提阶段，在此阶段主要考虑溶剂的选择。目前用于浸提紫杉醇的最普通溶剂是甲醇、乙醇等有机溶剂。xu和Liu采用的是甲醇-二氯甲烷(95:5，V/V)混合物，浸提时间为35~60min，而Hoke，和Powell，都选择的是纯甲醇，浸提时间则为16~48h。余广鳌等通过研究发现，在浸提过程