改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细
胞
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。

方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。

结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。

传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。

结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。

【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠
气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。

ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。

Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。

体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。

本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。

1 材料和方法
1.1 实验动物
SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。

饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。

1.2 主要仪器和试剂
倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 细胞培养
1.3.1 原代培养：10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在75%酒精溶液中浸泡1 min消毒皮肤(避开口鼻)，取出大鼠并固定于洁净手术台上，从腹部向上至颈部纵行剪开皮肤，打开腹腔，剪断腹主动脉放血后剪开胸腔，然后自颈部向下迅速分离气管及肺部组织，迅速置入预冷的4 ℃D-Hanks液中(含1%青链霉素)，转入超
净台，去除肺组织、血管、神经和结缔组织，分离出支气管树。

用显微镊仔细剥离去除外膜结缔组织，纵向剖开气管、各级支气管，用外科刀片轻刮内膜2～3次以去除上皮细胞。

然后弃气管和主支气管，收集叶支气管以下支气管树，并用眼科剪将组织剪成1 mm×1 mm或更小的组织块，移至15 mL离心管中，加入2 mL 0.2%的I型胶原酶溶液，玻璃滴管轻轻吹打混匀，置37 ℃、5% CO2孵箱中消化60 min。

取出后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min。

弃上清液，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基1 mL，吹打混匀后，转入25 mL培养瓶。

轻轻晃动培养瓶使组织块较均匀地铺满培养瓶底部，置37 ℃、5% CO2孵箱中半开放式培养，3 d后换液。

当2～3个组织块周围出现细胞生长时，即可添加培养液至3 mL，此后每隔2～3 d换液一次。

当组织块周围长出较多细胞时，组织块会自动脱落，并随换液而去除。

1.3.2 传代培养：当细胞生长融合成单层时，倒掉旧培养液，用PBS液清洗细胞1～2遍，弃清洗液，加入0.25%胰酶溶液1 mL，消化约3 min。

倒置显微镜下观察细胞收缩、变圆、细胞间隙增宽，即可加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化。

用玻璃滴管轻轻吹打瓶底使细胞脱落分散成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min。

弃上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×105/mL接种在培养瓶中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养。

一般一瓶细胞可传3～4瓶。

1.3.3 细胞纯化：首次传代时，将细胞悬浮液接种于培养瓶内
静置30 min，镜下观察有部分细胞贴壁，将未贴壁细胞转移到第2个培养瓶中，同法将第2瓶细胞静置30 min后，将未贴壁的细胞转移到第3个培养瓶，第3瓶细胞即为较纯的平滑肌细胞[3]。

以后利用平滑肌细胞的增殖优势，随着传代次数的增加，平滑肌细胞纯度会逐渐增高，以此达到去除其他细胞的纯化目的。

1.4 平滑肌细胞的鉴定
免疫细胞化学鉴定取第3代ASMCS，接种至预先放置于六孔板内的盖玻片上，制成细胞爬片，作SMα-actin免疫细胞化学染色，操作步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果
2.1 采用改良贴块法培养2～6 d，细胞开始以垂直方向从组织块边缘迁移萌出(见图1)，比传统贴块法早1～2 d[4]，游出细胞渐向外生长或近距离飘移形成散在细胞晕，进而形成细胞簇。

5～8 d在组织块附近出现“峰-谷”结构。

9～12 d多数组织块周围的细胞晕相互融合，即可首次传代。

原代培养的周期比传统贴块法短1～2 d。

2.2 细胞鉴定
2.2.1 形态学观察：倒置相差显微镜下，细胞未汇合之前多呈梭形、星形或不规则形，内有1～2个卵圆形细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突;细胞汇合后呈束状或螺旋状排列，呈现典型“峰-谷”状(峰：即多层细胞丘，可达8～10层;谷：即稀疏排列的单层细胞处甚至无细胞处)，这是平滑肌细胞的特征性生长表现(见图2)。

2.2.2 免疫细胞化学鉴定：对平滑肌细胞特异的α-actin进行免疫组化SP法染色，显微镜观察，95%以上细胞呈强阳性染色，胞浆呈棕黄色，胞核呈紫蓝色(见图3)。

3 讨论
传统的组织贴壁法培养原代气道平滑肌细胞虽然成本相对较低，但细胞从组织块萌出慢、培养周期长、较易污染和培养失败是其突出的缺点。

故笔者对传统的贴块法做了一些改进：①贴块前加用胶原酶短时消化组织块，使组织变疏松、柔软，表面张力变大，利于贴壁和细胞游出组织块，缩短培养周期[5]。

②省略干涸翻转的步骤。

传统贴块法培养过程中采用干涸翻转的方法，即等组织块接近干涸，再翻转培养瓶使组织块接触培养液[6]，翻转过早会导致组织块脱落，培养失败，翻转过迟又使组织块不能及时得到养分，细胞活力降低难以游出组织块，两者均降低培养的成功率。

笔者省略该步骤不仅简化操作，还能保证组织块及时获得营养，保证组织块中细胞的活力，利于游出组织块。

③取材：根据气道壁结构特点，叶支气管向下分级，软骨逐渐减少以致消失，而平滑肌逐渐增多，至细支气管和终末细支气管管壁出现完整的环形平滑肌层[7]，故取材时弃去含软骨环丰富而平滑肌少的气管与主支气管，选取叶支气管以下支气管树，组织质地较软，不仅易于贴壁，还可减少杂细胞的污染，提高培养纯度。

改良法培养的第3代细胞经免疫细胞化学鉴定纯度达95%。

本研究结果显示，采用改良贴块法可以使原代培养的周期缩短1～2 d，进而使得每次传代相应提早1～2 d，由于细胞传代时按
1:3～1:4传代，故细胞克隆呈3n～4n扩增，从而在相同的培养时间内，采用改良法可以大幅提高细胞产量。

由于原代培养周期缩短，组织块停留的时间缩短，减少了污染机会，笔者在实践中未发生过原代培养污染。

故改良法较传统的贴块法操作更简便、效率更高。

【参考文献】
[1] Hirst SJ, Martin JG, Bonacci JV, et al. Proliferative aspectsof airway smooth muscle[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004,114(2):S2-S17.
[2] Hirst SJ. Airway smooth muscle as a target in asthma[J].Clin Exp Allergy,2000,30(1):54-59.
[3] 卓致远,黄茂,崔学范,等.组织贴块法培养小鼠气道平滑肌细胞[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2007,16(2):247-250.
[4] 章杰,刘伟.平滑肌细胞的培养及应用[J].江西医药,2006,41(5):330-333.
[5] 唐槐静,段胜仲.胎儿动脉平滑肌细胞培养方法的研究[J].湖北医科大学学报,1999,20(2):89-91
[6] 景涛,刘建平,何国祥,等.组织贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞的探讨[J].中国现代医学杂志,2001,11(9):10-12.
[7] 刘斌.组织学与胚胎学[M].北京:北京大学医学出版社,2003:184-187.。