气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量1(祁彪)(精)

气相色谱法测定土壤中性糖和氨基糖含量

1. 方法原理

中性糖和氨基糖在吡啶 -甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应, 所得衍生物可利用气相色谱测定。由于土壤样品成分较复杂, 需要较多的处理过程,本试验采用内标法(内标为戊五醇,可以有效地消除系统误差和样品损失所带来的误差,增加实验的精密度和准确度。

2. 主要仪器

▪BEIFEN SP-3420A气相色谱仪, 配火焰离子化检测器 (FID, 北京北分瑞利分析仪器 (集团有限责任公司;

▪AT. SE-30型石英毛细管气相色谱柱(30m ×0.25mm ×0.25um 〔 100%二甲基聚硅氧烷;通用型非极性固定相;热稳定性达到 350℃;化学键合交联柱,可用溶剂清洗;极性相似于 DB-1, SPB-1, HP-1等固定相;符合 USP G1, G2, G38指定固定相〕,中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心;

▪RE-2000型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;

▪HP-5016SY 型氮吹仪,上海济成分析仪器有限公司;

▪FreeZone 6 plus cascsdo型冷冻干燥仪,美国 LABCONCO 公司;

▪DK-98-J 型电子恒温水浴锅,天津泰斯特仪器有限公司

▪Allegra 64R TD5A型台式高速离心机,美国 Beckman COULTER公司;

▪DHG-9240型烘箱,上海一恒科学仪器有限公司;

▪雷磁 PHS-3C 型 pH 计,上海精密科学仪器有限公司。

3. 主要试剂

8种中性糖标准 :核糖 (RIB、鼠李糖 (RHA、阿拉伯糖 (ARA、木糖 (XYL、葡萄糖 (GLU、半乳糖 (GAL、甘露糖 (MAN和岩藻糖 (FUC ;均购自 Sigma-Aldrich

公司;

4种氨基糖标准 :氨基葡萄糖 (GLU-N、氨基半乳糖 (GAL-N、氨基甘露糖(MAN-N和胞壁酸 (MUR,均购自 Sigma-Aldrich 公司;

内标:戊五醇(Adonitol ,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司;

其它试剂 :盐酸羟胺(Hydroxylamine hydrochloride,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司; 4-二甲氨基吡啶〔 4-(Dimethylamino pyridine〕,高纯试剂, Sigma-Aldrich 公司; 二氯甲烷(Dichloromethane ,色谱纯,天津市凯信化学工业有限公司;

乙酸乙酯(Acetic ether、正己烷(n-hexane ,均为色谱纯,山东省禹王实业总

公司化学试剂厂;

无水甲醇(Methanol ,色谱纯,天津光复精细化工有限公司;

吡啶、三氟乙酸(TFA ,均为分析纯,上海中秦化学试剂有限公司;

乙酸酐,分析纯,天津市化学试剂三厂;

盐酸,分析纯,白银西区银环化学制剂厂。

4. 溶液的配制

4. 1标准溶液和内标的配制:

8种中性糖和戊五醇的浓度均为 1 mg·mL -1, 水溶液配制 ;

四种氨基糖中除胞壁酸用无水甲醇配制浓度为 0.5 mg·mL -1外, 其它均为 1 mg·mL -1水溶液。 4. 2衍生试剂的配制:

4∶ 1的吡啶 -甲醇溶液,含有 32 mg·mL -1的盐酸羟胺和 40 mg·mL -1的 4-二甲基氨基吡啶。

5. 标液衍生:

氨基糖 :吸取用无水甲醇配制的胞壁酸溶液 150 ml,用氮吹吹干,各吸取其它三种氨基酸溶液 150 ml,加入到吹干的胞壁酸中溶解摇匀后,进行冷冻干燥,按照 6. 2所述方法衍生。

中性糖 :将配置好的上述水溶液,吸取 150ml ,直接进行冷冻干燥后,按照 6. 2所

述方法衍生。同时,对各标样单标按同法进行衍生。

6. 土壤样品的处理和衍生

6. 1中性糖和氨基糖水解及土壤样品前处理

(1 氨基糖。将含有约 4 mg有机碳 (不少于 0.3 mg氮的土壤样品置于水解瓶中, 加入 6 mol·L -1的 HCl 溶液 10 mL,加盖密封水解瓶,在 105 ℃下水解 8 h。冷却至室温后,加入 100 µg 戊五醇溶液 (内标 , 振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干, 残余物溶解于 20 mL蒸馏水中, 并用 0.4 mol·L -1的 KOH 溶液调节 pH 值至中性(pH 6.6~6.8,然后以 3000 r/min离心 10 min去除沉淀。上清液用冷冻干燥仪冻干,残留的固体物质用 3 mL无水甲醇溶解,再次离心 10 min以除去盐分。将上清液转移到 5 mL衍生瓶中,用 N 2在 45 ℃下吹干,加入 1 mL水。然后再次进行冷冻干燥(8 h 以上。实验中凡是盐酸参与的水解都采用此前处理方法。

(2 中性糖。将含有约 4 mg有机碳的土壤样品置于水解瓶中, 加入 4 mol·L -1

的 TFA 溶液 10 mL, 加盖密封水解瓶,在 105 ℃下水解 4 h。冷却至室温后,加入 100 µg 戊五醇溶液(内标,振荡摇匀后过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干,残余物溶解于 20 mL蒸馏水中,并用 0.4 mol·L -1的 KOH 溶液调节 pH 值为 6.6~6.8, 然后以 3000

r/min离心 10 min去除沉淀。取出上清液再次旋转蒸发干燥, 固体物质用 4 mL蒸

馏水溶解,然后转移到 5 mL衍生瓶中,进行冷冻干燥(8 h 以上。

6. 2衍生方法

向上述衍生瓶中加入300 μL衍生试剂〔前述 4.2〕 , 加盖密封, 在 75~80 ℃条件下加热 30 min, 其间振荡数次。冷却至室温后,加入 1 mL乙酸酐,密封再次加热 20 min。冷却后加入 1.5 mL的二氯甲烷。

过量的衍生试剂通过以下两步来去除:

首先,加入 1 mol·L -1 d的 HCl 溶液 1 mL,激烈振摇 30 s后,移走上层液体。

其次,与上面步骤相同,用 1 mL的蒸馏水至少洗涤 3次,在最后一次洗涤过程中尽可能去除水相。

剩余的有机相在 45 ℃下用 N 2吹干后,用400 μL的乙酸乙酯 -正己烷混合溶剂(V /V =1∶ 1溶解后转移至进样瓶中,即可进行气相色谱测定。

7. 气相色谱分析

载气为 N 2,流速 1.2 mL·min -1;进样量为 2.0 µL ,分流比为 30∶ 1; GC 进样口温度为 250 ℃,火焰离子化检测器(FID 温度为 300 ℃。以峰面积内标法定量。

中性糖分析色谱柱梯度升温程序为:柱温 175 ℃, 保持 4 min; 以 4℃ ·min -1的速度升温至 225 ℃, 保持 4.5 min;再以 30 ℃ ·min -1升温至 270 ℃,保持 2 min;最后以 30 ℃ ·min -1的速度升温至 300 ℃,保持 2 min。