如何快速可靠地找到差异蛋白质
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丙烯酰胺缓冲液: Immobiline® CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基
新pH范围的 Immobiline 干胶条
• 高分辨率的 IPG 胶条，联合使用DeStreak试剂, 能改善极碱性 区域蛋白点结果 。归功于独特的试剂。 • 使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D 图谱 分析效率! • 新pH范围:
2000 Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon™
2000
Pharmacia Biotech launched DALT II system
1998
Pharmacia Biotech introduced IPGphor™
1993
Pharmacia Biotech introduced ImageMaster™ suite
• 适合运行对光敏感的蛋白标记样品，电泳过程中 无需断电，可随时掀开避光盖子观察电泳情况；并 有开盖自动断电的高压保护装置 内置电源 • 电压：0 - 10000 V , 分辨率: 10 V • 电流：0 - 2.4mA, 分辨率： 0.01 mA • 功率：最大12 W 半导体温控：15–31°C±1°C 同时运行1－12根7－24cm的IPG胶条
New: Membrane proteins: 10 % SDS and larger volume of solution
McDonough J, Marbán E. Optimization of IPG strip equilibration for the basic membrane protein mABC1. Proteomics 5 (2005) 2892-2895.
Disease (Cell or tissue)
Control (Cell or tissue)
Analytical 2-DE
Subtractive Analysis
Analytical 2-DE
Variation, Additional spots, Missing spots, Intensity differences
双向电泳：传统方法
一向: 垂直胶管中进 行等电聚焦 urea, NP-40
sample
胶在SDS 缓 冲液中平衡
pH 10
二向:
SDS 丙烯酰胺凝胶电泳 非连续梯度胶
pH 3
pH 10
pH 3
按等电点分离（电荷）
按分子量分离（质量）
Principle according to P.H. O’Farrell and J. Klose (1975)
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣 蛋白点 的切取
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
其它实验 的进一步
验证
Differential Proteome Analysis
双向电泳原理
第一向:
变性的等电聚焦电泳根据蛋白 质的等电点分离
第二向:
SDS 聚丙烯酰胺电泳根据蛋白 质的分子量分离
一块双向电泳胶上可以分离几千个蛋白点
2D 电泳优越性
• 对未处理样本耐受性好
- 不需要预纯化 (如：色谱层析)
• 分辨率非常高 • 2D 是有效的组分收集器 • 蛋白在凝胶介质中受到保护 • 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ） • 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 • 与后续分析技术兼容性好 (如 MDLC)
特异蛋白质群的用处： •为疾病发病机制提供线索 •作为疾病诊断的分子标记 •用于治疗和药物开发的靶标
Preparative 2-DE In-gel digestion
Peptide mixture
MALDI-TOF-MS, ESI-MS-MS PMF, Sequencing
目前已取得进展的疾病：
•心血管疾病 •神经系统疾病 •肿瘤等重大疾病
• to cover and unfold polypeptides with SDS and DTT • glycerol and urea for minimizing EEO effects • to remove excess DTT to prevent point streaking
Görg A et al.: Elimination of point streaking on silver stained two-dimensional gels by addition of iodoacetamide to the equilibration buffer. Electrophoresis. 8 (1987) 122-124
ImageScanner III 图像扫描系统
灵活 -适合小胶和大胶，A3扫描面积 -透射和反射模式 高动力学范围 -0.00 到 3.8 O.D. 16bit灰度扫描 独有6线矩阵CCD技术 面积是普通CCD面积的四倍，从而提供了更高的速度 指标，降低了信噪比，使感光性能大大提高，堪称 CCD从设计到性能的全面突破。 精密的微透镜技术 有效将光线更加集中于感光性能最佳部位，感光度提 高30% 先进氙气灯,即时启动无需预热
ImageMaster Platinum 6.0 软件分析流程
ImageMaster Platinum 6.0: 找点功能强大
双向电泳面临的挑战
n 灵敏度 n 线性动态范围 n 重复性 n 定量精确性 n 质谱兼容与否
基于原图的真实分析
如何可靠地找到差异蛋白质？
由于疾病状态，药物处理，生命周期而引起的 差异
蛋白质组应用：
解决基本的生物学问题：
• 蛋白质的分布、鉴定、定性、定量分析 • 蛋白质的定位和翻译后修饰 • 细胞信号传导通路的研究 • 蛋白质间相互作用、蛋白质的功能
和重大疾病相关的问题：
• 寻找疾病相关的分子标志物 • 发现新药：药物作用的靶标、毒理和药理研究 • 疾病发病机制的研究
生物学问题 的提出
多种胶条槽可选
标准型单根独立设计的胶条槽 • 灵活选择每次运行胶条数量，一向 干胶条泡涨电泳一次完成
采用氧化铝陶瓷质地的胶条槽 • 可以保证充分的散热和电场分离效 果避免出现热点 • 胶条槽平整度好，长期使用不会变 形，确保胶条泡涨厚度均匀
Manifold多功能胶条盘 • 适合高通量7-24cm任意长度的IPG 胶条的等电聚焦和后续的平衡反应
载体两性电解质中进行IEF
Pharmalyte™
gel
Ampholine™
electric field
where R = H or - (CH2)x - COOH, x = 2 or 3
decreasing pI
long IEF time
固相 pH梯度 (IPG)
固相凝胶 (支持膜上0.5 mm 厚凝胶)
胶条槽表面有疏水涂层 有效防止蛋白黏附到胶条槽内壁上， 避免样品交叉污染
Equilibration of IPG strips
Prior to SDS electrophoresis the strips are equilibrated with:
2 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 30 % glycerol, BPB + (1 x 15 min) 1 % DTT (1 x 15 min) 2.5 % iodoacetamide
Immobiline™ DryStrip pH 3 – 5.6 NL Immobiline DryStrip pH 5.3 – 6.5 Immobiline DryStrip pH 6.2 – 7.5 Immobiline DryStrip pH 7 – 11 NL Immobiline DryStrip pH 3 – 11 NL
pH 11
56种IPG胶条可选
• 不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围 • pH7-11NL碱性胶条
Ettan IPGphor 3 第一向等电聚焦系统
IPGphor 3仪器控制软件 • 同时控制4台主机，分别执行不同的电泳参数 •实时监控电压、电流随时间的变化，完全掌握实验 的重复性 可调节水平的支角 • 确保胶条泡涨厚度均匀,样品均匀进入胶中,以防在 等电聚焦电泳中出现尿素析出影响蛋白聚焦的问题 灵活的可掀开的避光盖子
Wide pH gradient: 3 – 11 NL
pH 3
Mouse liver extract IPG 24 cm, pH 3-11 run with IPGphor
From A. Görg Proteomics Department Technische Universität Munich
诱导的生物学变化 —--要检测的差异
实验的因素 IEF/SDS-PAGE电泳条件的偏差 凝胶失真 实验者的操作误差
数据分析 操作者各自对数据的编辑和理解
Database searching
Identity of the query protein
Validation of protein, Function of protein
蛋白质组工作流程
液相流程 凝胶流程 比较分析
样本Sample(s)
样本制备
样本制备
酶解
双向分离
MDLC
图像获取
MALDI-MSn
第二向垂直电泳系统
琼脂糖覆盖密封
放置 IPG strip
低熔点琼脂糖
Ettan DALTtwelve 第二向电泳系统
• 一次运行 1至12 块 26x20cm 的 胶，适合 7-24cm 胶条 • 整和一体的半导体温控，温控效 率高,温控准确 • 内置的陶瓷热量交换器和缓冲液 循环泵，确保温控准确，保证实验 的高度重复性；仪器一体化设计好 ,占地面积小 • 缓冲液用量少~10L，省缓冲液,减 少试验成本
• 多根电极丝均匀分布 ，电场均匀，电泳时，每块胶的溴酚蓝前沿都非常直。可避免板式电极出现 的边缘效应,导致溴酚兰前沿的边缘弯曲，而减少凝胶的有效分离面积 • 电泳方向从上到下，阴极和阳极缓冲液分开，可使用不连续缓冲液系统，电泳速度快，分辨率好
Ettan DALTsix 第二向电泳系统
• 一次运行 1至6块 26x20cm 的胶 ，适合 7-24cm 胶条 • 内置的陶瓷热量交换器和缓冲液 循环泵，确保温控准确，保证实验 的高度重复性；仪器一体化设计好 ,占地面积小 • 缓冲液用量少~6L，省缓冲液,减 少试验成本 • 可以和其它电泳系统共有电源和 循环水浴，节省成本
1991
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
1973
1978
1982
LKB introduced Immobiline™
1979
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
The Multiphor™ flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003!
1967ຫໍສະໝຸດ Baidu
LKB introduced Ampholine™, the first commercial carrier ampholyte
如何快速可靠地找到差异蛋白质
什么是差异蛋白质？
环孢素A处理前
环孢素A处理后
正常 组织
肿瘤组织
如何快速找到差异蛋白质？
蛋白质组定义： 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对 应的全套蛋白质。
蛋白质组分类：
• 比较蛋白质组 (differential proteomics) • 表达蛋白质组 (expression proteomics) • 功能蛋白质组 (functional proteomics)
挖点 酶解
ESI-MSn
差异分析 DeCyder MS
点靶 MALDI PMF
验证
DIGE
差异分析 DeCyder 2D
双向电泳: 细胞的“快照”
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
2002
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE
新pH范围的 Immobiline 干胶条
• 高分辨率的 IPG 胶条，联合使用DeStreak试剂, 能改善极碱性 区域蛋白点结果 。归功于独特的试剂。 • 使用pH范围相互重叠的干胶条，可提高2-D 图谱 分析效率! • 新pH范围:
2000 Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon™
2000
Pharmacia Biotech launched DALT II system
1998
Pharmacia Biotech introduced IPGphor™
1993
Pharmacia Biotech introduced ImageMaster™ suite
• 适合运行对光敏感的蛋白标记样品，电泳过程中 无需断电，可随时掀开避光盖子观察电泳情况；并 有开盖自动断电的高压保护装置 内置电源 • 电压：0 - 10000 V , 分辨率: 10 V • 电流：0 - 2.4mA, 分辨率： 0.01 mA • 功率：最大12 W 半导体温控：15–31°C±1°C 同时运行1－12根7－24cm的IPG胶条
New: Membrane proteins: 10 % SDS and larger volume of solution
McDonough J, Marbán E. Optimization of IPG strip equilibration for the basic membrane protein mABC1. Proteomics 5 (2005) 2892-2895.
Disease (Cell or tissue)
Control (Cell or tissue)
Analytical 2-DE
Subtractive Analysis
Analytical 2-DE
Variation, Additional spots, Missing spots, Intensity differences
双向电泳：传统方法
一向: 垂直胶管中进 行等电聚焦 urea, NP-40
sample
胶在SDS 缓 冲液中平衡
pH 10
二向:
SDS 丙烯酰胺凝胶电泳 非连续梯度胶
pH 3
pH 10
pH 3
按等电点分离（电荷）
按分子量分离（质量）
Principle according to P.H. O’Farrell and J. Klose (1975)
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣 蛋白点 的切取
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
其它实验 的进一步
验证
Differential Proteome Analysis
双向电泳原理
第一向:
变性的等电聚焦电泳根据蛋白 质的等电点分离
第二向:
SDS 聚丙烯酰胺电泳根据蛋白 质的分子量分离
一块双向电泳胶上可以分离几千个蛋白点
2D 电泳优越性
• 对未处理样本耐受性好
- 不需要预纯化 (如：色谱层析)
• 分辨率非常高 • 2D 是有效的组分收集器 • 蛋白在凝胶介质中受到保护 • 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ） • 与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多 • 与后续分析技术兼容性好 (如 MDLC)
特异蛋白质群的用处： •为疾病发病机制提供线索 •作为疾病诊断的分子标记 •用于治疗和药物开发的靶标
Preparative 2-DE In-gel digestion
Peptide mixture
MALDI-TOF-MS, ESI-MS-MS PMF, Sequencing
目前已取得进展的疾病：
•心血管疾病 •神经系统疾病 •肿瘤等重大疾病
• to cover and unfold polypeptides with SDS and DTT • glycerol and urea for minimizing EEO effects • to remove excess DTT to prevent point streaking
Görg A et al.: Elimination of point streaking on silver stained two-dimensional gels by addition of iodoacetamide to the equilibration buffer. Electrophoresis. 8 (1987) 122-124
ImageScanner III 图像扫描系统
灵活 -适合小胶和大胶，A3扫描面积 -透射和反射模式 高动力学范围 -0.00 到 3.8 O.D. 16bit灰度扫描 独有6线矩阵CCD技术 面积是普通CCD面积的四倍，从而提供了更高的速度 指标，降低了信噪比，使感光性能大大提高，堪称 CCD从设计到性能的全面突破。 精密的微透镜技术 有效将光线更加集中于感光性能最佳部位，感光度提 高30% 先进氙气灯,即时启动无需预热
ImageMaster Platinum 6.0 软件分析流程
ImageMaster Platinum 6.0: 找点功能强大
双向电泳面临的挑战
n 灵敏度 n 线性动态范围 n 重复性 n 定量精确性 n 质谱兼容与否
基于原图的真实分析
如何可靠地找到差异蛋白质？
由于疾病状态，药物处理，生命周期而引起的 差异
蛋白质组应用：
解决基本的生物学问题：
• 蛋白质的分布、鉴定、定性、定量分析 • 蛋白质的定位和翻译后修饰 • 细胞信号传导通路的研究 • 蛋白质间相互作用、蛋白质的功能
和重大疾病相关的问题：
• 寻找疾病相关的分子标志物 • 发现新药：药物作用的靶标、毒理和药理研究 • 疾病发病机制的研究
生物学问题 的提出
多种胶条槽可选
标准型单根独立设计的胶条槽 • 灵活选择每次运行胶条数量，一向 干胶条泡涨电泳一次完成
采用氧化铝陶瓷质地的胶条槽 • 可以保证充分的散热和电场分离效 果避免出现热点 • 胶条槽平整度好，长期使用不会变 形，确保胶条泡涨厚度均匀
Manifold多功能胶条盘 • 适合高通量7-24cm任意长度的IPG 胶条的等电聚焦和后续的平衡反应
载体两性电解质中进行IEF
Pharmalyte™
gel
Ampholine™
electric field
where R = H or - (CH2)x - COOH, x = 2 or 3
decreasing pI
long IEF time
固相 pH梯度 (IPG)
固相凝胶 (支持膜上0.5 mm 厚凝胶)
胶条槽表面有疏水涂层 有效防止蛋白黏附到胶条槽内壁上， 避免样品交叉污染
Equilibration of IPG strips
Prior to SDS electrophoresis the strips are equilibrated with:
2 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 30 % glycerol, BPB + (1 x 15 min) 1 % DTT (1 x 15 min) 2.5 % iodoacetamide
Immobiline™ DryStrip pH 3 – 5.6 NL Immobiline DryStrip pH 5.3 – 6.5 Immobiline DryStrip pH 6.2 – 7.5 Immobiline DryStrip pH 7 – 11 NL Immobiline DryStrip pH 3 – 11 NL
pH 11
56种IPG胶条可选
• 不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围 • pH7-11NL碱性胶条
Ettan IPGphor 3 第一向等电聚焦系统
IPGphor 3仪器控制软件 • 同时控制4台主机，分别执行不同的电泳参数 •实时监控电压、电流随时间的变化，完全掌握实验 的重复性 可调节水平的支角 • 确保胶条泡涨厚度均匀,样品均匀进入胶中,以防在 等电聚焦电泳中出现尿素析出影响蛋白聚焦的问题 灵活的可掀开的避光盖子
Wide pH gradient: 3 – 11 NL
pH 3
Mouse liver extract IPG 24 cm, pH 3-11 run with IPGphor
From A. Görg Proteomics Department Technische Universität Munich
诱导的生物学变化 —--要检测的差异
实验的因素 IEF/SDS-PAGE电泳条件的偏差 凝胶失真 实验者的操作误差
数据分析 操作者各自对数据的编辑和理解
Database searching
Identity of the query protein
Validation of protein, Function of protein
蛋白质组工作流程
液相流程 凝胶流程 比较分析
样本Sample(s)
样本制备
样本制备
酶解
双向分离
MDLC
图像获取
MALDI-MSn
第二向垂直电泳系统
琼脂糖覆盖密封
放置 IPG strip
低熔点琼脂糖
Ettan DALTtwelve 第二向电泳系统
• 一次运行 1至12 块 26x20cm 的 胶，适合 7-24cm 胶条 • 整和一体的半导体温控，温控效 率高,温控准确 • 内置的陶瓷热量交换器和缓冲液 循环泵，确保温控准确，保证实验 的高度重复性；仪器一体化设计好 ,占地面积小 • 缓冲液用量少~10L，省缓冲液,减 少试验成本
• 多根电极丝均匀分布 ，电场均匀，电泳时，每块胶的溴酚蓝前沿都非常直。可避免板式电极出现 的边缘效应,导致溴酚兰前沿的边缘弯曲，而减少凝胶的有效分离面积 • 电泳方向从上到下，阴极和阳极缓冲液分开，可使用不连续缓冲液系统，电泳速度快，分辨率好
Ettan DALTsix 第二向电泳系统
• 一次运行 1至6块 26x20cm 的胶 ，适合 7-24cm 胶条 • 内置的陶瓷热量交换器和缓冲液 循环泵，确保温控准确，保证实验 的高度重复性；仪器一体化设计好 ,占地面积小 • 缓冲液用量少~6L，省缓冲液,减 少试验成本 • 可以和其它电泳系统共有电源和 循环水浴，节省成本
1991
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
1973
1978
1982
LKB introduced Immobiline™
1979
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
The Multiphor™ flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003!
1967ຫໍສະໝຸດ Baidu
LKB introduced Ampholine™, the first commercial carrier ampholyte
如何快速可靠地找到差异蛋白质
什么是差异蛋白质？
环孢素A处理前
环孢素A处理后
正常 组织
肿瘤组织
如何快速找到差异蛋白质？
蛋白质组定义： 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对 应的全套蛋白质。
蛋白质组分类：
• 比较蛋白质组 (differential proteomics) • 表达蛋白质组 (expression proteomics) • 功能蛋白质组 (functional proteomics)
挖点 酶解
ESI-MSn
差异分析 DeCyder MS
点靶 MALDI PMF
验证
DIGE
差异分析 DeCyder 2D
双向电泳: 细胞的“快照”
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
2002
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE