正确理解定量蛋白质组学
定量蛋白质组学研究技术
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四 针对性亲和标签技术
磷酸化蛋白质同位素标识亲和标签
➢ PHIAT技术是建立在ICAT技术基础上旳研 究和鉴定磷酸化蛋白质磷酸化位点旳新措施， 且对低丰度蛋白质旳鉴定有效。
➢ PHIAT试剂具有亲核旳巯基和同位素标签及 其共价结合旳生物素基团。
➢ 利用此措施已成功鉴定了酪蛋白和酵母提取 物旳磷酸化位点。
经 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标识必需氨基酸亲和 肽段旳N末端。因为肽段旳乙酰化位点 不一，被标识旳重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
➢ 每一种试剂都涉及三部分：一种报告基 团（分子量分别为114u、115u、116u 和117u）、一种平衡基团（分子量分别 为31u、 30u、29u和28u）和一种与 肽段反应旳基团。
➢ 当我们需要同步比较四组不一样品时， 样品分别跟四种iTRAQ试剂结合，然后 混合在一起做质谱鉴定。
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♣ 可裂解同位素标识亲和标签
✓ 用13C/12C替代了2H/1H ✓ 使用了酸裂解连接子 ✓ 不同肽段质量相差9u或9u旳倍数 ✓ 亲和标签试剂由3部分构成
• 半胱氨酸特异性反应基团 • 含9个同位素13C或12C标签旳可裂解连接子 • 亲和纯化生物素
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
prm靶向定量蛋白质组学
prm靶向定量蛋白质组学
蛋白质组学是一种研究蛋白质的系统性方法，它不仅可以揭示蛋白质组中哪些蛋白质存在，还可以揭示蛋白质之间的相互作用和相互调节，以及蛋白质在细胞功能中的作用机制。
近年来，随着蛋白质组学技术的发展，prm靶向定量蛋白质组学
也逐渐成为一种普遍的蛋白质组学技术。
prm靶向定量蛋白质组学是一种高灵敏度的蛋白质组学技术，它采用了多种分析方法，有效地分离出大量的蛋白质，并对不同的蛋白质进行定量分析，从而获得蛋白质的组成和功能。
在这种技术的支持下，我们不仅可以发现哪些蛋白质存在，而且还可以发现不同蛋白质之间的相互作用和调节，从而深入了解蛋白质在细胞功能中的作用机制。
prm靶向定量蛋白质组学技术可以有效地解决蛋白质组学
困境，它可以有效地分离出大量蛋白质，并且比传统方法更加准确、高效。
它还可以通过定量分析获得蛋白质组成和功能，从而有助于我们更好地理解蛋白质在细胞功能中的作用机制。
另外，prm靶向定量蛋白质组学技术还可以用于研究药物的靶
向作用，从而可以有效提高药物研究的效率。
总之，prm靶向定量蛋白质组学是一种有效的蛋白质组学
技术，它可以有效地分离出大量的蛋白质，并且可以通过定量分析获得蛋白质的组成和功能，从而为我们更好地理解蛋白质在细胞功能中的作用机制奠定基础。
未来，随着科学技术的发
展，prm靶向定量蛋白质组学将为蛋白质组学研究提供更强的支持，揭示出更多的蛋白质组学信息。
蛋白组学蛋白定量值_概述说明以及解释
蛋白组学蛋白定量值概述说明以及解释引言部分的内容如下：1.1 概述：蛋白组学是研究生物体内所有蛋白质的组成、结构和功能的科学领域。
随着技术的发展，蛋白组学已成为生物医学研究中重要的一部分。
在蛋白组学研究中，蛋白定量值是一个关键概念，它可以用来描述不同样本中特定蛋白质的相对或绝对表达水平。
1.2 文章结构：本文将从以下几个方面来探讨蛋白组学蛋白定量值的概述以及解释。
首先，在第二部分将介绍什么是蛋白组学，并探讨蛋白定量值在其中的意义。
然后，我们将详细介绍与蛋白定量值相关的技术和方法。
接下来，在第四部分将进一步探讨蛋白定量值在生物医学研究和临床应用中的重要性，并通过实例分析展示其角色和相关发现。
最后，在结论与展望部分总结文章内容，并提供未来蛋白组学蛋白定量值研究的发展方向和挑战，同时给出对读者的启示和建议。
1.3 目的：本文的目的是概述和解释蛋白组学中的蛋白定量值，并介绍相关的技术和方法。
同时，我们将探讨蛋白定量值在生物医学研究和临床应用中的重要性，以及未来该领域可能面临的挑战。
通过本文，读者将能够了解到蛋白组学蛋白定量值在科学研究和医学实践中的关键作用，并为进一步开展相关研究提供参考和启示。
2. 蛋白组学蛋白定量值概述说明2.1 什么是蛋白组学蛋白组学是指研究生物体内全部蛋白质及其表达、结构、功能和调控的科学领域。
在过去几十年里，蛋白组学得到了长足的发展，并成为生命科学研究中一个重要的分支领域。
通过大规模研究与分析生物体内的蛋白质，我们可以深入理解细胞功能、信号通路、代谢途径以及疾病发展机制等关键过程。
2.2 蛋白组学中的蛋白定量值意义蛋白定量值是指对特定样本中不同蛋白质的含量进行测定和比较分析的结果。
通过准确测量和比较不同条件下样本中特定蛋白质的丰度水平，我们可以揭示细胞或生物体在生理或病理状态下基因表达与调控发生的变化，从而进一步了解相关信号通路以及与疾病相关的分子机制。
同时，对于药物发现和临床应用来说，准确测定蛋白质的定量值也对理解药物的作用机制和疗效评估具有重要意义。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学是一门研究蛋白质组含量及其变化的学科。
百泰派克生物科技提供基于质谱的定量蛋白组分析服务。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学，就是对一个基因组表达的全部蛋白质或者一个复杂混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量与鉴定。
定量蛋白组学是蛋白质组学研究的一个重要分支。
蛋白质的表达水平与生命活动息息相关，因此对蛋白质进行定量分析对阐明蛋白质的生物学功能和细胞的各种生物进程十分重要。
定量蛋白质组学研究技术
现在常用的蛋白质组定量的方法根据定量手段的不同可以分为荧光定量技术、蛋白质芯片技术和基于质谱的定量技术。
荧光定量技术是二维凝胶电泳技术与荧光染色技术相结合的一种技术，运用荧光染料标记蛋白质，在2D胶上进行分离和鉴定，按照荧光强度差异来比较蛋白量的变化。
蛋白质芯片技术是通过蛋白质芯片从待测样品中捕获配体后，利用激光共聚焦显微镜或质谱等检测技术进行蛋白质组定量分析的。
基于质谱的蛋白组定量技术通过比较具有相同离子化能力的蛋白或多肽的质谱峰强弱，可以对它们进行相对定量。
相对于其他技术，该技术不仅可以测定肽序列，而且可以准确定量蛋白质。
目前基于质谱的定量蛋白质组学技术主要分为标记（Label）和非标记的（Label Free）两大类，其中标记的又可分为体内标记（如SILAC标记）以及体外标记（如 iTRAQ、TMT 标记）。
定量蛋白质组学。
5蛋白组学定量蛋白质组学
d0/d4标记蛋白质N末端原理
HH H
H
HH
H
2
H
2
H4-Nic-NHS[1-(H4-烟酰氧基)琥珀酰亚胺] 四氘代 H4-Nic-NHS[1-(H4-烟酰氧基)琥珀酰亚胺]
23
MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with
succinic anhydride and deuterated succinic anhydride
36
–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
37
羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
38
缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
通过离子交换层析图 谱上峰的面积，可以 计算两种肽段的相对 量 0.88 : 1
35
MCAT优点
O-甲基异脲(O-methylisourea)对Lys残基εNH2的胍基化程度可以进行量上的控制
增加的质量（每个胍基42 Da）可以很容 易在MS上检测到
ε-NH2的胍基化修饰并不影响肽段的离子 化和带电荷程度
31
MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
32
MCAT策略流程：定量
蛋白质质谱数据 绝对定量
基于MRM 的蛋白质组学实验流程
复旦大学
MRM 实验的设计、优化
1.目标蛋白质组的选择: 依据先前的实验或者是文献,以及 网络资源寻找赶兴趣的蛋白
2.目的肽段的选择：
（a）选择目标蛋白特有的多肽来监测 （b）离子化和碎裂好的肽段更易被检测，灵敏度高，优先选择 （c）确保所选的肽段的 m/z值与所用仪器质量范围相匹配 (6-20个氨基酸） （d）如果可能，尽量不要选用含有易被化学修饰或发生重排的氨基酸 (例如：M,C等）
Analytical Chemistry, 2004
复旦大学
2.基于电感耦合等离子体质谱测定元素的蛋白质绝对定量
磷酸化肽 段混合物 BNPP (内标） BNPP: bis(4-nitrophenyl) phosphate 与磷酸化肽段性质类似
混合物
HPLC–ICPMS
HPLC–ESIMS
I31P
tret/min MS/MS
不足： 用含磷的化合物BNPP作为内标， 在质谱上的响应与肽段的响应 还是会出现细微的差别，从而 给该方法的定量带来误差。
Angew. Chem. Int. Ed. 2007
复旦大学
3.非同位素标记的肽段用于蛋白质组的绝对定量
通过向样本中加入不同 浓度的标准人肌红蛋白 绘制标准曲线，曲线的 反向延长线与横坐标交 点的相应横坐标值即为 此方法测定的实际样本 中人肌红蛋白的绝对浓度
1053.6
1072.5764
1074.8
1089.5776
1096.0
100
1223.9
90
脱氨峰
80
70
% Intensity
60
50
40
30
silac定量蛋白质组学
SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture）是一种定量蛋白质组学方法，利用稳定同位素标记氨基酸在细胞培养中进行蛋白质定量研究。
以下是SILAC定量蛋白质组学的基本原理和步骤：
1. 原理：
-SILAC利用稳定同位素标记前体氨基酸替代细胞培养基中的天然氨基酸。
-在不同条件下，分别使用含有正常氨基酸和稳定同位素标记的氨基酸的培养基培养细胞。
-标记的氨基酸会在细胞内代谢成稳定同位素标记的蛋白质。
2. 实验步骤：
-细胞培养：将细胞分成两组，一组在正常氨基酸培养基中培养，另一组在稳定同位素标记的氨基酸培养基中培养。
-细胞提取：收集培养的细胞，并提取蛋白质。
-混合和消化：将两组样品的蛋白质混合，并进行消化，一般使用胰蛋白酶将蛋白质消化成肽段。
-肽段分离：使用液相色谱等技术分离肽段。
-质谱分析：使用质谱仪进行肽段的定性和定量分析。
3. 数据分析：
-利用质谱数据分析软件对得到的质谱数据进行解析和比较。
-通过计算同位素标记和未标记肽段的峰面积比例或峰高比例，实现不同样品中蛋白质的定量比较。
-根据定量结果，进一步分析差异表达蛋白质在功能和通路上的富集和变化。
SILAC定量蛋白质组学方法具有高准确性和灵敏度，适用于研究细胞生物学、疾病研究和药物筛选等领域。
它可以提供关于差异表达蛋白质的定量信息，促进对蛋白质功能和分子机制的深入理解。
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正确理解定量蛋白质组学上期分享的蛋白组学内容，是不是有些小伙伴还绕在云里雾里呀？这次，小编用实例说话，帮您梳理清楚。
Label-free定量Label-free定量，顾名思义就是不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free技术又可分为基于谱图数（Spectra Count，简称SC）和基于肽段母离子强度（或色谱离子流的峰面积即XIC）两种方法，后者更准确，使用更广泛。
技术特点无需标记，操作简单；不受比较样品数限制；对实验操作稳定性、重复性要求高；准确性较标记定量差；要求至少做三次技术重复或生物重复。
适用范围适合大样本量的定量比较；对无法用标记定量实现的实验设计，易用label-free技术；经典案例题目：Label-free global serumproteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins infamilial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技术进行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白质组分析，寻找Celecoxib调控蛋白）期刊：Cancer genomics proteomics主要技术：Label-free定量文章摘要：Celecoxib是一种环氧合酶选择性抑制剂，能够对患有预防家族性腺瘤性息肉病（FAP)和散发性大肠癌的病人进行防治。
为了识别其具体的作用机制，本文采用多维色谱分离方法结合电喷雾串联质谱，使用Label-free定量技术，比较经Celecoxib 处理前、后血清样品的蛋白质组表达量差异。
发现了83个可能为Celecoxib响应的表达量显著差异蛋白。
通过Western blotting方法，在FAP病人和结肠直肠癌细胞系中进一步确认了一些Celecoxib调控蛋白，为进一步进行Celecoxib作用机制的大规模临床试验奠定了基础。
图：Apo A-II蛋白中特征肽的定量结果比较注：AB为处理前，CD为处理后Fatima N,Chelius D et al. Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics.文献来源：Fatima N, Chelius D, Luke BT, Yi M, Zhang T, Stauffer S, Stephens R,Lynch P, Miller K, Guszczynski T et al: Label-free global serumproteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins infamilial adenomatous polyposis patients. Cancer genomicsproteomics 2009, 6(1):41-49.iTRAQ定量iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同重同位素标签标记的相对和绝对定量)技术也是目前定量蛋白质组学中应用最广泛的技术。
iTRAQ试剂分为报告基团、平衡基团和肽反应基团。
报告基团共有8种（113、114、115、116、117、118、119、121 Da)。
肽反应基团能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价链接，从而将报告基团和平衡基团标记在肽段上；平衡部分质量分别为192~184，与报告部分相加正好为305。
在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。
在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(113~121) 的峰，根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。
技术特点灵敏度高：可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；分离能力强：可分离出酸/碱性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、难溶性蛋白；高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠准确：定性与定量同步进行，同时得出鉴定和定量结果。
自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
适用范围适用于任何类型的样本；一次最多能标记8个样本；经典案例题目：A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis（一种基于多胺Hypusine轴（Polyamine-hypusine axis）的新型肿瘤抑制网络）期刊：Nature主要技术：iTRAQ定量文章摘要：为寻找淋巴瘤的抑癌基因，首先通过筛选短发夹RNA文库的方法，识别出一些抑制后会引起小鼠淋巴瘤模型肿瘤扩增的基因。
然后采用iTRAQ定量技术对两个有意义的淋巴瘤抑癌基因——AMD1和Eif5A的表达调控进行研究，发现这两个基因都与Hypusine(Hypusine是一种独特的氨基酸，由一种高保守途径产生的多胺代谢产物)相关。
通过进一步的二次筛选，确定了多胺Hypusine轴的新型抑癌基因网络，这一网络能调控细胞凋亡。
图：iTRAQ定量流程和蛋白质比值分布图Scuoppo C, Miething C et al. A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature.文献来源：Scuoppo C, Miething C, Lindqvist L, Reyes J, Ruse C, AppelmannI,Yoon S,Krasnitz A, Teruya-Feldstein J, Pappin D et al: A tumoursuppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature2012, 487(7406):244-248.SILAC定量SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies,稳定同位素标记技术）为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案。
SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。
不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。
技术特点高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；定量精确，线性范围广，降低由于样品制备、实验操作和仪器设备造成的实验误差，定量重复性好；体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制；由于该技术属于体内标记，标记效果稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量；与化学标记相比，SILAC方法蛋白需要量明显减少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量；活体标记，更接近样品真实状态；相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记。
适用范围只适用于活体培养的细胞，对于生物医学研究中常用的组织样品、体液样品等无法分析。
经典案例题目：Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells（采用甾醇探针结合SILAC定量技术在哺乳动物细胞中分析胆固醇-蛋白质相互作用）期刊：Nat Methods主要技术：SILAC定量文章摘要：胆固醇是细胞膜的重要结构成分，也是前体的信号分子，在很大程度上通过与蛋白质的特异性相互作用调控参与发挥其作用。
本文采用可点击的光敏甾醇探针结合SILAC蛋白质组定量技术直接在活体细胞中全面解析了胆固醇-蛋白相互作用。
最终确定了超过250个胆固醇结合蛋白，包括受体、通道蛋白和涉及许多已建立和之前未报告相互作用的酶。
新发现的蛋白质相互作用中最突出的是调节糖、甘油脂和胆固醇本身以及参与囊泡运输和蛋白质糖基化和降解蛋白质的酶。
这些蛋白指向关键节点的生化途径，说明甾醇浓度和其他代谢物的控制可能和蛋白定位以及修饰高度相关。
图：实验基本流程图：胆固醇生物合成通路注：黑色字符蛋白表示没有鉴定Jonathan J et al. Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells.Nature methods.文献来源：Jonathan J, Armand B, Micah J, Sarah E, Benjamin F: Proteome-wideMapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells.Nature methods, 2013 March;10(3):259-264.SW ATH定量SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）是瑞士苏黎世联邦理工学院的RuediAebersold博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是MS/MSALL技术的一种扩展。
它将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息。
技术特点灵敏度高：SWATH技术继承了MRM的数据采集模式，结合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus，具有与MRM相当的灵敏度；可重现性高：重复样品间的定量相关性可达0.99以上；线性动态范围广：定量范围可跨越4个数量级；通量大：一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量。