SILAC定量蛋白质组学
silac定量蛋白质组学, 囊泡运输机制
在定量蛋白质组学的超酷世界中，有一个叫做SILAC（细胞文化中氨基酸的Stable Isotope Labeling）的游戏变化工具，它类似于研究蛋白质行为方式的秘密剂。
它通过潜入特殊，标签的氨基酸进入细胞的蛋白质组成，有点像卧底间谍。
在质谱学的帮助下，科学家们用普通的，无标签的间谍们来修正这些狡猾的间谍的数量，以便揭开蛋白质是如何变化的，作用有多快，甚至如何在蛋白质被制成后被修改的各种秘密。
这个技术被用来揭开从细胞如何相互交谈，如何决定自己长大后想要成为什么，甚至如何在疾病中无赖。
这就像解锁一个超级酷，蛋白质谜充满惊喜！
SILAC 定量蛋白质组学在研究细胞如何在小气泡中移动东西方面起到了超级的作用。
这个过程，叫做维辛运输，对于把蛋白质和脂质带到细胞中需要去的地方来说，是极为重要的。
使用SILAC，科学家可以测量蛋白质水平和周转量的变化，当它们与流体运输路径相混淆时。
这能帮助他们弄清楚这一切是如何运作的。
SILAC的研究发现了控制冰球交通的老板分子，展示了冰球的移动方式，并解释了蛋白质的微小变化会如何影响冰球的形成和与细胞其他部分的结合。
SILAC定量蛋白质组学的实施使我们在理解细胞内病毒运输的复杂过程方面取得了显著进展。
这种方法可以精确地测量蛋白质丰度和周转量的变化，从而发现以前未识别的调节器和车辆运输路径效应器。
SILAC在数量上评估遗传或药理学干预对车辆运输的影响的能力，在加深我们对这一基本细胞机制的了解方面发挥了关键作用。
随着定量
蛋白质组学领域继续取得进展，很明显，SILAC仍将是调查不同生物背景的蛋白质动力学和调控机制的不可或缺的技术。
SILAC定量蛋白质组学
2.4 SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
千里之行 始于足下 感谢聆听
SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg 的培养基中添加Lys和Arg的 同位素Lys(D4或13C6 15N4)、 Arg(13C6,或13C6 15N4)等培 养细胞，使蛋白质被标记成 “中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组 蛋白质、SDS-PAGE电泳、染 色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋 白酶消化，质谱分析。
2.1 Conclusion
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2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用
J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223–239，2019
2.3 SILAC研究蛋白质与DNA相互作用
Genome Res. 2009 19: 284-293
In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease
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1：SILAC定量蛋白质组学原理
1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程
1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式
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1.1：SILAC定量蛋白质组学原理
SILAC定量蛋白质组学
将SILAC技术应用于更多生物学问题研究中，如药物筛选、 疾病机制研究等。
智能化与自动化
开发基于人工智能和机器学习的SILAC数据分析方法和自动 化实验流程，提高实验效率和数据分析的智能化水平。
04
SILAC定量蛋白质组学研 究案例
案例一：肿瘤蛋白质组学研究
总结词
通过SILAC技术，对肿瘤细胞系进行蛋白质组学分析，发现与肿瘤发生、发展相关的关键蛋白质。
对分离后的蛋白质进行质谱分 析，比较标记和非标记蛋白质 的相对丰度。
细胞培养
将细胞培养在含有稳定同位素 标记的氨基酸的培养基中，使 细胞合成标记的蛋白质。
蛋白质分离
通过凝胶电泳或色谱技术将蛋 白质进行分离。
数据分析
对质谱数据进行处理和分析， 得出蛋白质的相对定量结果。
SILAC的优势与局限性
优势
SILAC技术具有高灵敏度、高准确性 和高重复性，适用于大规模蛋白质组 学研究，能够同时对多个蛋白质进行 定量分析。
互作验证
02
03
互作动力学
SILAC技术可以用于验证已知的 蛋白质相互作用，以及发现新的 相互作用。
此外，SILAC技术还可以用于研 究蛋白质相互作用的动态变化， 有助于深入了解细胞生理过程。
蛋白质修饰研究
修饰鉴定
利用SILAC技术可以鉴定出蛋白质的修饰，如磷酸化、糖 基化、乙酰化等。
01
修饰定量
详细描述
SILAC技术用于标记肿瘤细胞系中的蛋白质，通过比较正常细胞和肿瘤细胞的蛋白质表达谱，发现差 异表达的蛋白质，进而研究这些蛋白质在肿瘤发生、发展中的作用。
案例二：神经科学蛋白质组学研究
总结词
应用SILAC技术分析神经细胞蛋白质组， 揭示神经细胞功能和信号转导机制。
SILAC（定量蛋白质组学）技术原理
SILAC（定量蛋白质组学）技术原理
作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具，质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究，鉴定蛋白质和**后修饰。
于是，科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
早期的蛋白质研究致力于鉴定并了解单个蛋白或蛋白复合物的功能，这些年，仪器和技术的进步大大促进了蛋白质组学研究。
这种蛋白质组学的研究，与当今热门的基因组、转录组和代谢组等领域的研究一起，让我们更好地了解了整体的生物过程，以及它们如何应对不同刺激，或在**状态下如何改变。
若想了解一个人患病之后，基因表达水平发生了怎样的改变，DNA芯片是一个常见的选择。
然而DNA 芯片也许并没有说出全部，因为基因表达的差异并不直接对应着蛋白表达的差异。
为了更准确地比较两个样本的蛋白水平，科学家们通常使用双向电泳外加质谱，然而流程复杂，通量低，重复性也欠佳。
为什么不能定量?因为各次运行之间，水解后的肽段在理化性质上表现出很大差异，从而导致质谱响应的变化。
此外，质谱只能对样品中的一部分肽段进行分析。
定量蛋白质组学又分为相对定量和定量。
相对定量方法(如SILAC、ICAT、ICPL等)是用来比较样品之间的蛋白或肽段丰度；而在未标记的样品中加标有已知浓度的同位素标记的合成肽段，就实现了目标肽段的定量。
显然，定量比相对定量更为理想，因为不同样品的肽段值也可用于比较相对蛋白变化。
然而，相对定量却更为常用，因为每个目的蛋白的定量都需要昂贵的试剂，也需要花费大量的时间来开发分析。
在相对定量方法中，SILAC又是比较常用的一种。
非靶向蛋白组学定量技术
非靶向蛋白组学定量技术: SILAC, iTRAQ, TMT定量蛋白组学的研究意义人类基因组完整图谱于2003年正式公布，这标志着生命科学的里程碑性事件——人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究也进入了后基因组时代。
这一计划的初始目的是在基因层面研究人类疾病机制，设计基因药物，进行精准医疗。
但是时隔十多年年过去了，效果远没预期的理想。
其中主要原因可能是，我们现有的研究工作和背景知识不足以将庞杂的基因组数据直接同人类疾病联系起来。
而蛋白组学能更直观的将基因与疾病联系起来，逐渐成为研究热点之一。
定量蛋白组学是将某一基因组或者某一复杂体系表达的全部蛋白质进行鉴定和精准定量的学科，是蛋白组学研究的重要分支。
基于质谱的蛋白质定量20实际80年代中期出现了MALDI（基质辅助激光解吸附电离）和ESI（电喷雾电离）两种软电离方法，可以将蛋白质或者多肽离子化，从而引入质谱仪种进行定性和定量分析，从此生物质谱技术成为蛋白组学最重要的分析工具之一。
图1. 生物质谱仪器。
利用生物质谱技术，主要有两种蛋白组学研究策略：Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二维凝胶电泳分离蛋白，再将完整蛋白直接离子化后引入质谱分析，借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，从而实现对蛋白的鉴定。
Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先将样品用酶进行处理，多维色谱分离后引入质谱分析，再借助生信分析工具和蛋白数据库进行数据比对，最后实现对蛋白的鉴定。
蛋白定量分为相对定量和绝对定量，由于电泳技术具有重复性差等缺点，而多维色谱能将样品酶解物稳定分离，因此蛋白的绝对定量多采用自下而上的方法。
虽然绝对定量似乎更为理想，但是绝对定量更为复杂和昂贵，而相对定量在很多时候就能满足科研需求，因此，相对定量更为常用。
利于质谱技术，可根据特定质谱峰的信号强度来确定蛋白质含量，主要的方法又分为非靶向定量蛋白组学（标记定量和非标记定量）和靶向定量蛋白组学。
定量蛋白质组学的方法有哪些
定量蛋白质组学的方法有哪些？1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。
而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。
对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。
生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。
基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。
2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRM HR)、和SW ATH。
简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。
因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
2.2 iTRAQiTRAQ定量是目前定量蛋白质组学应用很广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，可同时对8个样本进行分析，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
silac定量蛋白质组学
silac定量蛋白质组学摘要：I.介绍- 蛋白质组学- silac 定量蛋白质组学技术II.silac 技术的基本原理- 稳定同位素标记- 细胞培养条件下的应用III.silac 技术的应用- 蛋白质定量- 蛋白质组差异分析IV.silac 技术的优缺点- 优点- 高精度- 高效率- 缺点- 成本较高- 技术复杂V.总结- silac 技术的意义- 展望未来正文：I.介绍蛋白质组学是研究细胞或组织中所有蛋白质组成、表达和功能的一门科学。
近年来，随着蛋白质组学技术的不断发展，越来越多的研究者开始关注于定量蛋白质组学。
其中，silac 定量蛋白质组学技术是一种广泛应用的方法。
II.silac 技术的基本原理Silac，全称为“稳定同位素标记氨基酸在细胞培养条件下的应用”，是一种基于稳定同位素标记技术的定量蛋白质组学分析方法。
在这种方法中，研究人员首先将细胞培养在含有稳定同位素标记氨基酸的培养基中。
这些标记氨基酸会参与到蛋白质的合成过程中，从而使得蛋白质中带有标记。
随后，研究人员通过质谱分析，对带有标记的蛋白质进行定量分析。
III.silac 技术的应用Silac 技术广泛应用于蛋白质定量、蛋白质组差异分析等领域。
通过这种技术，研究者可以在同一实验条件下，对不同样本中的蛋白质进行精确定量，从而揭示蛋白质表达的差异。
此外，silac 技术还可以应用于蛋白质翻译后修饰的研究，以及对蛋白质表达调控机制的探究。
IV.silac 技术的优缺点Silac 技术具有较高的精度和效率，可以在短时间内得到大量蛋白质的信息。
然而，这种技术的成本较高，且技术复杂，需要专门的设备和技术支持。
此外，silac 技术还存在一定的局限性，例如，某些特殊类型的蛋白质（如糖基化蛋白质）在silac 技术中难以定量。
V.总结总的来说，silac 技术为定量蛋白质组学提供了有力的工具。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一，可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前，蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理，使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测（MRM）、定量蛋白质鉴定（iTRAQ）和标记蛋白质鉴定（TMT）等。
多重反应监测（MRM）是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆（triple quadrupole）进行分析。
首先，确定待测蛋白质的肽段序列，然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来，使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析，测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后，通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算，得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定（iTRAQ）是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中，待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后，将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量，通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度，可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定（TMT）是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中，多个待测样品用不同的同位素标记，然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法，定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹（Western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）等。
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1.2.2：细胞标记与测试
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1.1：SILAC定量蛋白质组学原理
SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg 的培养基中添加Lys和Arg的 同位素Lys(D4或13C6 15N4)、 Arg(13C6,或13C6 15N4)等培 养细胞，使蛋白质被标记成 “中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组 蛋白质、SDS-PAGE电泳、染 色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋 白酶消化，质谱分析。
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SILAC定量蛋白质组学
1：SILAC定量蛋白质组学原理 2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
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1.2.4：结果形式
LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果 将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表达量：
2: SILAC应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学实例 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
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2.1 Conclusion
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2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用
J. Cell Biol. Vol. 183 No. 2 223–239，2008
1.1：SILAC定量蛋白质组学原理
技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法
（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测 测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞 或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两 种氨基酸，操作方便。
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2.1：SILAC定量蛋白质组学实例
辉663
2.1 Schematic for SILAC
SILAC实验流程图
2.1 MS spectra showing the four major patterns of phosphorylation observed
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1：SILAC定量蛋白质组学原理
1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程 1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式
培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培 养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过 滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重” 型培养基。
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SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度 辉骏生物：/ 免费服务热线：400-699-1663
2.1 Quantification of phosphorylation by SILAC
Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio>1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosine phosphorylation level,and those with ratios<0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease
1.2.2：细胞标记与测试
标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2 天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。 添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞 相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐 成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为 10KDa.
2.3 SILAC研究蛋白质与DNA相互作用
Genome Res. 2009 19: 284-293
2.4 SILAC研究蛋白质与RNA相互作用
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1.2.3：蛋白质分离与质谱分析
（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量 混合，SDS-PAGE分离，染色。 （2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。 （3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL™)分析，数据检索。
细胞经过传代培养7天后，同一肽段被“重”型肽段取代
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1.2.3: 实验处理
当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行 细胞处理，如药物处理，病毒处理等。
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1.2.1：培养基准备
材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷 型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), LLysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。