定量蛋白质组学研究技术.
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学是生物科学中重要的研究领域，它们帮助我们更深入地了解蛋白质在生物体内的功能和调控机制。
在这篇文章中，我们将介绍这两个领域的基本概念、研究方法和应用。
定量蛋白质组学是研究蛋白质组中蛋白质的表达水平和相对丰度的方法。
通过比较不同条件下蛋白质的表达差异，我们可以了解到蛋白质在生物体内的功能和调控机制。
定量蛋白质组学通常使用质谱技术，如液相色谱质谱法（LC-MS/MS），来对蛋白质进行定量分析。
这项技术可以同时鉴定和定量成千上万种蛋白质，从而提供全面的蛋白质组信息。
靶向蛋白质组学是研究特定蛋白质或蛋白质家族的表达、结构和功能的方法。
与定量蛋白质组学相比，靶向蛋白质组学更加注重深入研究某些特定蛋白质在生物体内的作用机制。
靶向蛋白质组学通常使用特定的抗体或亲和剂来选择性地富集和检测目标蛋白质。
这种方法可以帮助我们了解特定蛋白质的功能、调控和相互作用网络。
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学在许多生物学研究领域中都有广泛的应用。
比如，它们可以用于研究疾病的发生机制和诊断标志物的发现。
通过比较疾病组织和正常组织中的蛋白质表达差异，我们可以找到与疾病相关的蛋白质，并开发相应的治疗方法。
此外，定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学还可以应用于药物研发和药物靶点的鉴定。
通过研究药物与特定蛋白质的相互作用，我们可以更好地理解药物的作用机制和效果。
定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学是生物科学中重要的研究领域，它们帮助我们深入了解蛋白质的功能和调控机制。
通过定量蛋白质组学和靶向蛋白质组学的研究，我们可以揭示生物体内复杂的蛋白质相互作用网络，并为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
这些研究为我们更好地认识生命的奥秘提供了重要的工具和手段。
定量蛋白质组学
定量蛋白质组学五种常用蛋白质组学定量分析方法对比。
百泰派克生物科技汇总介绍了五种常见定量蛋白质组学分析方法的优势和特点。
SWATH-MS数据可重复性研究。
SWATH在不同实验室间可重复性的研究。
这个研究统计了全世界11个不同的实验室中使用SWATH鉴定的数据重复度情况。
iTRAQ/TMT标签结构以及相对定量原理详解。
通过标记多组不同样品，iTRAQ和TMT能够同时比对正常组织样品和肿瘤组织样品的蛋白水平差异，以及精准检测肿瘤在发展的不同阶段的蛋白水平变化。
蛋白质定量技术及其在临床研究中的应用。
百泰派克采用高通量质谱平台提供蛋白质定量服务，包括定量蛋白质组学，蛋白质定量技术及其他蛋白质组学相关的服务。
百泰派克生物科技独立仪器分析平台，拥有多年蛋白质定量经验，竭诚为您服务。
蛋白组分析中dda和prm。
DDA和PRM是质谱不同的数据采集模式。
DDA主要用于非靶向蛋白质组学的研究，PRM则用于靶向蛋白质组学的研究。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DDA、MRM/PRM和DIA蛋白质组学分析服务。
iTRAQ定量蛋白质组学。
iTRAQ蛋白质组学即iTRAQ定量蛋白质组学，是一种标记定量蛋白质组学，指利用iTRAQ标记技术和质谱技术对蛋白质组进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的iTRAQ定量蛋白质组学分析服务。
蛋白互作定量检测。
蛋白互作定量检测指对相互作用的蛋白质进行定量。
百泰派克生物科技提供基于质谱的SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作定量分析服务，可同时实现互作蛋白质组的定性和定量。
DIA蛋白质组学样品处理步骤。
DIA蛋白质组学指利用DIA技术（如SWATH）对样品中的蛋白质组进行检测分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的DIA蛋白质组学分析服务和蛋白质样品制备服务。
功能蛋白质组学。
功能蛋白质组学是蛋白质组学的一部分，其主要目的是研究蛋白质的功能和生命活动的分子机制。
百泰派克生物科技提供基于质谱的功能蛋白质组学分析服务。
定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组学技术随着科技的发展，科学家们逐渐掌握了理解生物组成和生物学过程的能力。
其中最有前景的技术之一就是定量蛋白质组学技术。
那么什么是定量蛋白质组学技术呢？本文将围绕这一问题来介绍这项技术。
一、什么是定量蛋白质组学技术？定量蛋白质组学技术是利用高通量质谱技术分离和分析细胞或组织中存在的蛋白质，同时识别这些蛋白质在不同生物学状态下的表达变化。
通俗地说，它是一种通过观察和比较蛋白质在不同状态下的表达程度，得出蛋白质的功能和进一步的研究方向。
二、定量蛋白质组学技术的实现步骤（1）样本收集和制备首先需要准备样本，样品的采集和样品制备是定量蛋白质组学技术中非常关键的步骤。
正确的样品制备可以确保得到的蛋白质质量和数量的准确性。
这一步骤要求科学家考虑到实验设计、样品提取、洗涤和分离蛋白质的方法等多种因素，以进行比较有价值的定量蛋白质组学分析。
（2）蛋白质的消解和分离在样品制备之后，需要进行蛋白质消解和分离。
消解和分离需要先对蛋白质进行断裂和分离，这可以通过多种不同的方法完成，包括化学方法和生物物理学方法。
（3）质谱分离和检测在进行蛋白质的消解和分离后，需要将其转化为质谱可探测的形式。
这可以通过液相色谱与质谱联用，通过对洗脱色谱的样品进行质谱分离和检测，最后得到蛋白质中的定量信息。
（4）数据分析最后，科学家需要利用数据分析方法来获取蛋白质在细胞或组织中不同生物学状态下的表达变化数据。
这包括统计学分析、峰检测、数据可视化等方法。
三、应用领域定量蛋白质组学技术的应用领域广泛。
它在癌症、心血管疾病、肾脏病、神经疾病和生理学等多个学科领域都有应用。
例如，有研究表明，通过定量蛋白质组学技术可以研究药物作用机制、生物标志物和药物靶标。
在精神类疾病方面，也有相关研究表明，在慢性使用大麻后，定量蛋白质组学技术可以检测出相关蛋白质的变化，这些变化与记忆和认知功能的损害有关。
总的来说，定量蛋白质组学技术在许多生物学和医学领域都有广泛应用，可以帮助科学家更好地了解细胞和组织的生物学功能和疾病发展机制，并为开发新药和治疗方案提供更精细的信息。
定量蛋白质组学LC-MS-MS
百泰派克生物科技
定量蛋白质组学LC-MS-MS
定量蛋白质组学是蛋白质组学的一个重要分支，这个概念的提出使蛋白质组学的研究内容从定性向精确含量鉴定方向进一步发展。
目前，常用的蛋白质组学定量技术是基于质谱的技术，根据其是否使用同位素标记又分为标记策略（Label）和非标
记策略（Label Free），标记策略如TMT、iTRAQ和SILAC等。
LC-MS-MS即液相色
谱-串联质谱技术，是各种蛋白质质谱定量技术中所不可缺少的分析技术，也是实
现蛋白质定量的关键步骤。
其将经过不同标记或处理得到的蛋白肽段利用液相色谱进行分离后再进行多级质谱分析，根据肽段离子的质谱信号如离子峰强度等结合生物信息学分析手段计算各肽段的含量，从而实现整个蛋白质的含量鉴定。
百泰派克生物科技采用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC纳升色谱技术，提供高效精准的定量蛋白质组学LC-MS-MS服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析。
定量蛋白质组学
Amersham 2D-DIGE
第二节
运用质谱进行定量的蛋白质 组分析技木
一.稳定同位素代谢标记技术 该方法由Oda提出,其具体作法是，如在 两组酵母细胞平行生长的培养基中，一组含 有天然氮同位素组分(14N，99.6％；15N，0.4 ％)；另一组基质相同，但富含15N(＞96％)。 经过一段时间培养后,将细胞裂解，然后将这 两组蛋白质等量混合，通过凝胶电泳分离和 染色后，找出差异表达蛋白质，将其从凝胶 中挖出，酶解后，用MAIDI-TOF分析。
Analyze peptide peak ratios
5. MS/MS
Obtain sequence info
Examples of Real Data using ICAT
MS
MS/MS
优点：ICAT具有广泛的兼容性
主要表现在： 第一.能够兼容分析任何条件下体液、细胞 组织中绝大部分蛋白质； 第二.烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂 (如尿素、盐酸胍等)存在下都可进行； 第三.只需分析含cys残基的肽段，从而降低 了蛋白混合物分析的复杂性； 第四.允许任何类型的生化、免疫、物理的分 离法．因此能很好地定量分析微量蛋白质。
新的技术 1.荧光染色（标记）技术与考马斯亮蓝染色
法或银染法相比，能更好满足于上述几点
要求，从而能够应用于定量蛋白质组学研究 2.稳定同位素代谢标记的方法和同位素亲和 标签技术巧妙解决了质谱仪不能应用于对 蛋白质点的定量分析的缺点
第一节 利用荧光染料进行 定量的蛋白质组分析技术 适用于检测蛋自质的荧光染料有两类: 一种类是用于蛋白质荧光染色，如Sypro Ruby 和 RuBS 另一类用于蛋白质的荧光标记，如Cy2,Cy3和 Cy5,可进行荧光双向差示凝胶电泳。
蛋白质组学定量
蛋白质组学定量蛋白质组学是生物学领域中一个受到重视的分支学科，它对研究细胞结构和功能有着重要意义。
定量蛋白质组学是一个复杂的研究领域，它可以帮助我们更好地理解细胞的结构和功能，并预测疾病的发生。
蛋白质组学定量是利用生物质谱技术和其他技术（如质谱、分析技术、定量技术等）对蛋白质进行定量检测的一种方法。
通过此种方法，可以比较一个细胞中不同蛋白质的相对表达量，并研究各种细胞表型的变化，有助于研究物种的进化和调控关系的研究。
蛋白质组学定量的有效实现，需要建立一个高效的细胞样本处理和分析流程。
生物质谱技术是分析一个细胞中不同蛋白质的相对表达量的基本技术。
它可以用来检测蛋白质的组成和表达水平，以及表达水平的变化，这是包括蛋白组学定量在内的所有细胞表型研究的基础。
其他重要技术包括高效液相色谱（HPLC）和高效毛细管电泳（CE），它们可以用来分析不同蛋白质的组成和表达水平，以了解蛋白质组织中表达水平的变化，并分析表达水平变化和细胞生物学表型之间的相互关系。
蛋白质组学定量的有效进行也需要建立一个有效的数据处理和分析管道。
有效的数据处理和分析管道可以帮助我们更好地理解不同蛋白质的组织和表达水平，以及表达水平变化和细胞生物学表型之间的相关性。
为了有效的实现蛋白质组学定量，必须建立一个完整的数据处理管道，包括获取样本、处理样本、定量表达水平和分析定量数据等步骤。
蛋白质组学定量实践中，在处理数据方面，它们也需要建立一个有效的数据分析系统，以便对测定的数据进行有效的分析和统计。
另外，除了细胞表型研究外，蛋白质组学定量还可以用来研究疾病的进化和调控关系。
例如，通过蛋白质组学定量，可以比较不同组织中不同疾病患者蛋白质表达水平的差异，从而了解疾病机理。
因此，蛋白质组学定量是一个重要的研究领域，其有效进行需要建立一个有效的数据处理和分析流程，以及建立一个有效的数据分析系统，通过这些流程，研究者可以更好地理解蛋白质组的组成和表达水平，以及表达水平变化和细胞生物学表型之间的相互关系，帮助我们了解细胞的结构和功能，以及预测疾病的发生。
蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法蛋白质组学定量分析是对细胞或组织中的蛋白质进行定量分析的一种方法。
它是研究蛋白质组学的重要手段之一，可以揭示蛋白质的表达差异、功能变化以及相关的生物学过程和疾病机制。
目前，蛋白质组学定量分析的方法主要包括质谱定量法和定量免疫学方法。
质谱定量法是蛋白质组学定量分析的主要方法之一。
它基于质谱技术和同位素标记原理，使用质谱仪对样品中的蛋白质进行定量分析。
目前常用的质谱定量方法包括多重反应监测（MRM）、定量蛋白质鉴定（iTRAQ）和标记蛋白质鉴定（TMT）等。
多重反应监测（MRM）是一种常用的质谱定量分析方法。
它利用质谱仪中的三重四极杆（triple quadrupole）进行分析。
首先，确定待测蛋白质的肽段序列，然后合成同位素标记的肽段标准品作为内标。
接下来，使用质谱仪对待测蛋白质和内标进行质谱分析，测量待测蛋白质和内标的特定肽段的质荷比和峰面积。
最后，通过内标的峰面积和待测蛋白质的峰面积进行定量计算，得到待测蛋白质的表达量。
定量蛋白质鉴定（iTRAQ）是一种基于同位素标记的质谱定量方法。
在iTRAQ 实验中，待测组织或细胞培养基中的蛋白质经过胰蛋白酶消化后，将消化产物用不同的同位素标记。
这些标记反应产物有不同的质量，通过质谱分析可以得到有关各组分的数量比。
通过比较标记反应产物的相对丰度，可以定量分析待测蛋白质的表达差异。
标记蛋白质鉴定（TMT）是一种与iTRAQ类似的同位素标记质谱定量方法。
TMT 实验中，多个待测样品用不同的同位素标记，然后将这些样品混合在一起通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
通过质谱分析可以得到不同样品中蛋白质的相对表达量和差异表达蛋白质的鉴定。
定量免疫学方法也是蛋白质组学定量分析的重要方法之一。
相比于质谱定量法，定量免疫学方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点。
常用的定量免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、西方印迹（Western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）等。
标记定量蛋白质组学
标记定量蛋白质组学
标记定量蛋白质组学是一种用于分析生物样本中蛋白质表达水平的技术。
它通过使用稳定同位素标记的氨基酸来对蛋白质进行标记，然后利用质谱技术对标记的蛋白质进行定量分析。
标记定量蛋白质组学的基本原理是利用稳定同位素标记的氨基酸（如 13C、15N 等）来替换蛋白质中的某些氨基酸。
这些稳定同位素标记的氨基酸在生物体内代谢过程中不会发生明显的化学变化，因此可以用来追踪和定量蛋白质的表达水平。
在实验过程中，将不同处理条件下的生物样本分别用稳定同位素标记的氨基酸进行培养，使蛋白质中的某些氨基酸被标记。
然后将这些样本混合在一起进行蛋白质提取和质谱分析。
在质谱分析过程中，标记的氨基酸会产生不同的质量数，通过比较不同质量数的蛋白质丰度，可以定量分析不同处理条件下蛋白质的表达水平差异。
标记定量蛋白质组学技术具有高灵敏度、高准确性和高通量等优点，可以同时定量分析大量蛋白质，并且可以检测到低丰度的蛋白质。
它已经被广泛应用于生物医学研究、药物研发、生物技术等领域。
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细胞工程教研室
细胞工程教研室
荧光扫描仪
细胞工程教Leabharlann 室细胞工程教研室三 同位素标记技术
♫ 原理
多肽和蛋白质的质谱响应值受许多难以控制的 因素的影响，特别是其离子化效率受其他物质 和条件的影响很大，具有很强的体系依赖性， 因而不能对来自相同肽段两次质谱检测得到的 信号强度像色谱定量中那样进行比较定量。
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✓ 细胞培养条件下稳定同位素标签技术 （SILAC） 通过细胞的正常代谢，把稳定同位素标 记的氨基酸引入到蛋白质组成中，大大 简化质谱定量分析前人工处理的复杂度。 可用在细胞培养条件下的稳定同位素有： 2H、13C和15N等。
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۩ 酶解过程引入标记
➢ 18O/16O水
➢ 2-DE-MS技术体系
• 无标记的蛋白质双向电泳 • 荧光差异凝胶电泳 • 基于同位素标签和自动化的串联质谱
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☻定量分析方法
✓ 定性差异分析和定量差异分析 ✓ 绝对定量和相对定量 ✓ 凝胶差异分析和非凝胶差异分析 ✓ 标记定量法和无标记定量法
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二 荧光染料分析法
♣ 双向电泳（2-DE）凝胶染料显示 ✓ 考马斯亮蓝 ✓ 银染 ✓ 荧光染色 ✓ 荧光标记
第九章 定量蛋白质组学研究技术
石晓卫 E-mail：xwshi205@
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定量蛋白质组学
• 定量蛋白质组学是指把一个基因组 表达的全部蛋白质或一个复杂的混 合体系中的目标蛋白质进行精确定 量和鉴定。
• 这一概念的提出标志着蛋白质组技 术的不断改进和完善。蛋白质组学 研究已从对蛋白质简单的定性向精 确的定量方向发展。
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♣ 荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）
➢ 目前，在传统2-DE技术的基础上发展出的2DDIGE，采用专有的荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5） 与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上 可同时分离多个由不同荧光标记的样品，并以 荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质 点和每个差异都可以进行统计学可信度分析， 从而具有良好的重复性和较高的准确率。
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一个肽的惟一适合的内标准是标记有稳定同位 素的同一个肽。所以，在完整蛋白或消化后的 多 肽 中 引 进 稳 定 同 位 素 （ 如 2H 、 13C 、 15N 、 18O）标记的小分子，用来识别不同样品来源 的肽段，经“轻”质和“重”质同位素标记的 不同多肽互相作为内标，化学性质基本上是一 样的，这样就可以确保同一次质谱扫描中两者 的离子化效果是相同的，此时肽质谱峰信号成 对出现，质谱峰的信号强度就可以作为定量的 依据。它们的相对强度就精确地反映了原样品 中多肽的比例（也就是蛋白的比例）。
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♫ 分类
➢ 同位素标签引入方法
• 生物代谢方式 • 化学方式 • 酶解过程引入
➢ 同位素标记引入法
• 体内标记【代谢标记法（SILAC）】 • 体外标记【化学标记法（ICAT）】
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۩ 生物代谢方式引入标记
➢ 原理
将一定量的相同种类但表达水平不同的 两个（细胞）样品分别置于正常培养介 质和富含某重质同位素（如：15N）的相 同介质中培养，一定时间后将两者混合 酶解，然后选择性亲和分离、色谱分离， 并进行质谱分析。
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细胞工程教研室
主要内容
※ 定量技术体系与分类 ※ 荧光染料分析法 ※ 同位素标记技术 ※ 针对性亲和标签技术 ※ 同位素标记技术的应用
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一 定量技术体系和分类
☻ 技术体系
✓ 双向电泳-质谱技术体系 ✓ 蛋白质芯片分析体系 ✓ 基于同位素标记的质谱分析技术体系
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ICAT试剂组成： 反应基团（特异 性结合肽链中半 胱氨酸残基的巯 基） 连接子（结合稳 定同位素） 亲和标签—生物 素（可与卵白素 结合，选择性分 离标记的多肽）
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➢ 操作流程
同位素标记亲和 标签轻试剂标记 的细胞蛋白质1
同位素标记亲和 标签重试剂标记 的细胞蛋白质2
混合， 胰酶水解
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۩亲和标签法引入标记
➢ 原理
同位素标记亲和标签技术（ICAT）由Gygi等 于1999年发明。此技术是利用同位素亲和标签 试剂，预先选择性地标记某一类蛋白质，分离 纯化之后进行MS鉴定。根据MS图上不同同位 素标记亲和标签试剂标记的一对肽段离子的强 度比值定量分析样品的相对丰度。
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阳离子交换
卵白素 亲和层析
LC分离，MS分析， 数据库检索
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➢ 优点
✓ 兼容任何生长条件下的组织中的蛋白质样品； ✓ 烷基化反应高度特异； ✓ 只分离含有半胱氨酸残基的肽段，降低了体
系的复杂性； ✓ 可对膜蛋白进行鉴定和定量； ✓ 建立在色谱技术的基础上，任何促进蛋白质
在两个要比较的蛋白质样品的酶解过程中分别 加入18O和16O水，这样可特异性地对酶解肽段的 C末端进行标记，等量混合后进行质谱分析样 品间蛋白质组的差异。混合样品须快速鉴定。
➢ 酶解标记H218O
在H218O的溶液中进行蛋白质酶解，可在其C端 稳定结合1或2个18O原子。
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➢ 整体内标技术（GIST）
通 过 用 N-acetoxy-[2H3]-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS) 乙 酰 化 处 理酶解肽段，把同位素标签引入样本分 析体系中。NAS可标记必需氨基酸亲和 肽段的N末端。由于肽段的乙酰化位点 不一，被标记的重链和轻链质量差也不 固定，给自动化分析带来了一定困难。
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➢ 方法
✓ 15N/14N蛋白质标记技术 分别用富含15N/14N的细胞培养基培养要 比较的细胞或者简单生物体，通过生物 代 谢 的 方 式 以 15N 替 代 氨 基 酸 组 成 中 的 14N ， 进 而 把 15N 标 记 引 入 蛋 白 质 组 成 中 。 由于氨基酸组成的不固定（从甘氨酸的 1个到精氨酸的4个），因此还没有把此 标记用在细胞培养上的报道。