iTRAQ定量蛋白质组学解析
itraq蛋白质组技术的原理和一般流程
I. 概述1. 介绍itraq蛋白质组技术的概念和意义itraq（isobaric tags for relative and absolute quantification）蛋白质组技术是一种高通量的质谱技术，广泛应用于蛋白质组学研究中，能够同时对多个蛋白质进行定量分析。
由于其高度灵敏度和高效性，itraq蛋白质组技术在生物医学研究领域中扮演着重要的角色。
II. itraq蛋白质组技术的原理1. itraq标记原理itraq蛋白质组技术的关键在于标记技术，其原理是通过化学方法在蛋白质样本中引入具有不同质量的同位素标记物，从而实现对蛋白质的定量分析。
itraq试剂包含一个受阴离子的部分、一个杂环胺基和一个羧酰亚胺可以与肽发生反应。
2. itraq标记技术itraq标记技术的过程包括样本制备、标记、复杂样品分离、质谱分析等步骤，标记过程中要注意将样品分成不同组别，分别添加不同的itraq试剂进行标记，之后混合样品进行后续分析。
III. itraq蛋白质组技术的一般流程1. 样品制备itraq蛋白质组技术的样品制备对后续的标记和分析至关重要，一般的样品制备包括蛋白提取、蛋白定量、蛋白消化等步骤，确保样品制备的完整性和准确性。
2. 蛋白质标记在样品制备完毕后，需要进行itraq标记。
将不同组别的样品分别添加相应的itraq试剂进行标记，标记的严谨性和准确性对后续实验数据的可信度具有重要影响。
3. 复杂样品分离经过标记的样品需要进行分离，一般采用高效液相色谱或离子交换色谱对样品进行分离，以确保后续质谱分析的准确性。
4. 质谱分析经过样品制备、标记和分离后的样品需要进行质谱分析，itraq蛋白质组技术中常用的是质谱-质谱技术，利用质谱仪对样品进行定量分析。
IV. 结语1. 引述itraq蛋白质组技术在蛋白质组学研究中的重要性itraq蛋白质组技术作为一种高通量的质谱技术，为蛋白质组学研究提供了强大的工具和方法，通过对多个蛋白质进行定量分析，加深了我们对细胞蛋白质组学的理解，对疾病的研究和诊断起到了重要的作用。
iTRAQ定量蛋白质组学技术
iTRAQ定量蛋白质组学技术现在有一种很火的蛋白定量技术叫做iTRAQ，相信很多接触过蛋白组学方面研究的童鞋们都有耳闻，不过可能大多数人对它没有比较深入的了解，现在我们一起来好好了解下这种超厉害的定量蛋白质组学技术。
概念啥是iTRAQ呢？相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术是美国应用生物系统（AB SCIEX）公司与2004年推出的一种全新的体外同重同位素标记的相对与绝对蛋白组定量技术。
该同位素标记法利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端和赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，能够高通量地寻找不同蛋白质组的差异蛋白并且准确进行相对或绝对定量，是近年来定量蛋白质组学中应用广泛的高通量筛选技术。
产生背景随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代，以基因组研究成果为基础，各种先进技术为支撑，进一步研究生物有机体的全部蛋白质结构，功能以及相互作用的蛋白质组学是目前的研究热点。
蛋白质组学的真正含义在于，在整体，动态，网络的水平上对蛋白质进行定量定性分析，对生命活动进行全面深入的认识。
仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示细胞的突变过程。
因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。
过去，科学家通常先进行凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。
可是，这种方法既不是非常敏感，也不是非常精确，对我们研究蛋白组有局限性。
科学家们一直在探索蛋白组学研究方法。
现在，基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。
定量蛋白组学是蛋白质组学的一个重要组成部分，即对一套基因组表达的全体蛋白或某一复杂的混合物体系中所有蛋白质进行定量和鉴定。
itraq定量蛋白质组学原理
itraq定量蛋白质组学原理iTRAQ（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification）定量蛋白质组学是一种广泛应用于蛋白质定量的方法。
它通过标记蛋白质样品中的氨基酸残基，利用质谱技术进行定量分析。
iTRAQ 定量蛋白质组学原理基于同位素标记和质谱分析的原理，具有高灵敏度、高通量和高精确度的特点，被广泛应用于生物医学研究、药物发现和临床诊断等领域。
iTRAQ定量蛋白质组学的核心原理是通过同位素标记来比较不同样品中蛋白质的相对和绝对丰度。
在实验开始前，将不同样品中的蛋白质样本分别进行消化，得到氨基酸片段。
然后，使用iTRAQ试剂对氨基酸片段进行标记。
iTRAQ试剂由一个报告离子和一个结构相似但质量不同的标记离子组成。
这些标记离子具有相同的化学性质，但在质谱分析中会产生不同的质荷比。
通过不同样品中蛋白质样本的标记，可以将它们在质谱分析中区分开来。
在质谱分析中，标记的蛋白质样本会经过离子化和碎裂，产生一系列的碎片离子。
这些碎片离子会根据它们的质荷比被质谱仪进行检测和记录。
通过比较不同样品中的标记离子的相对丰度，可以确定蛋白质在不同样品中的相对丰度。
而通过比较标记离子的绝对丰度，可以确定蛋白质在不同样品中的绝对丰度。
iTRAQ定量蛋白质组学的优势在于它能够同时分析多个样品，提供更全面的信息。
通过一次实验，可以同时比较多个样品中的蛋白质丰度差异。
同时，iTRAQ定量蛋白质组学具有较高的灵敏度和准确性，能够检测到低丰度的蛋白质，并且可以提供相对和绝对丰度的定量信息。
然而，iTRAQ定量蛋白质组学也存在一些限制和挑战。
首先，iTRAQ试剂的成本较高，限制了其在大规模研究中的应用。
其次，iTRAQ定量蛋白质组学在样品预处理、质谱分析和数据解析等方面需要较为复杂的技术和专业知识。
同时，由于iTRAQ试剂的标记机制，会导致定量结果的一定偏差。
因此，在应用iTRAQ定量蛋白质组学时，需要进行严格的实验设计和数据分析，以确保结果的准确性和可靠性。
iTRAQ蛋白组学
百泰派克生物科技
iTRAQ蛋白组学
iTRAQ蛋白组学定义
iTRAQ是一种基于标签的蛋白质定量技术，中文名称为同位素标记相对和绝对定量。
iTRAQ蛋白组学通过iTRAQ技术对蛋白组进行鉴定和定量研究。
iTRAQ蛋白组学研究方法
iTRAQ技术通过同位素标记来实现蛋白质定量研究，经水解的蛋白质其多肽N末端
或赖氨酸侧链基团可以被同位素标记，通过高精度质谱仪串联分析，可同时对最多
8个样品进行鉴别和定量。
利用iTRAQ技术研究蛋白组学具有如下优势：一次实验
可实现多达8个样品蛋白质的高通量鉴定和定量；该技术是在肽段水平上进行的体外标记，没有物种特异性限制，理论上可用于所有物种的蛋白质定量研究。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供iTRAQ定量蛋白组分析一站式服务。
欢迎免费咨询152-****7680。
iTRAQ技术
同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ 技术）简介：iTRAQ 技术（同位素相对标记与绝对定量技术）是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术能够得到：一般500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质表达的差异。
。
i TRAQ 试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。
应用：• 同时标记8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量 • 非常高的通量• 可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测，• 可以分析详细分期／型的临床疾病样本，并可设计样本重复• 甚至可以进行个体样本的研究• 细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学技术特点和优势• 定量敏感、反应速度快• 标记完全，标记效率高达97%以上• 较高的重复性，能简化谱的复杂程度、提高离子强度• 可对多达八种不同样本同时进行定量分析• 定性与定量同时进行实验大致流程：操作时首先是对不同蛋白质样品分别进行酶解，并采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合，结合多维色谱分离和后续的串联质谱鉴定，从而实现对不同来源样品蛋白进行分离和鉴定的目的，我们可以提供8重标记iTRAQ 标记，可以对多达8种不同样本同时进行定量分析。
原理：i TRAQ 试剂包含八种不同的胺活性试剂。
每种胺活性试剂与水解后肽段结合。
胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。
下图为整个的实验流程：1.不同的蛋白质样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8,首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）.2.采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合。
3.使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱。
4.8个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个峰。
5.对加入标记的肽段进行二级质谱，这时，平衡基团从报告基团上脱落。
6.二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119和121，其强度分别代表8个标记的样品的同一个肽段。
ITRAQ串联质谱对于蛋白质组学的分析
Application example
利用iTRAQ 技术处理了猪肝细胞中的1476 种蛋白对其中880 种蛋白 进行分析，在错误识别率小于 5% 条件下,他们发现一些与能量代谢、 分解代谢、生物合成、电子传递、氧化还原酶类反应等有关的蛋白含量 都大大增加了，这些蛋白在肝脏作为化学和能量工厂这一角色中都起着 重要的作用． iTRAQ 技术鉴定了芸苔属植物保卫细胞中的相对蛋白成份． 他们用 相对定量的方法在经脱落酸处理过的样品中和对照组中鉴定出 431 种蛋 白质．在含量丰度相对上调的 66 种蛋白质中，与应激和防御有关的蛋 白占大多数． 38 种蛋白的含量丰度下调了，其中许多都与新陈代谢和 蛋白合成有关． 也未曾有人报道过这些蛋白与脱落酸敏感或与气孔的 开合有关． 他们的研究不仅建立了一个完整的脱落酸敏感蛋白库，而 且鉴定出几种新的蛋白，为后续研究其在植物保卫细胞中的功能奠定了 基础
Introduction
相对和绝对定量同位素标记( isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ ) 技术是 美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体 外同位素标记技术.使用该技术可以寻找差异表达蛋 白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达 的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质 进行精确定量和鉴定.如今，iTRAQ 技术已经在蛋白 质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用
Methods
2. 胰酶消化蛋白
（1）在每个新的胰酶瓶中加入25 μL超纯水溶解胰酶 ↓ （2）漩涡震荡使胰酶充分溶解，短暂离心 ↓ （3）每个样品管中加入2~10 μL胰酶溶液。 ↓ （4）漩涡震荡混匀，短暂离心 ↓ （5）37 ℃保温过夜（12~16 hrs）
基于iTRAQ蛋白分析技术初步探索红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制研究
基于iTRAQ蛋白分析技术初步探索红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制研究一、内容综述随着科学技术的不断发展，人们对生物衰老机制的研究越来越深入。
在众多抗衰老方法中，红参粉作为一种具有抗氧化、抗炎、抗疲劳等作用的天然保健品，受到了广泛关注。
本研究采用基于iTRAQ蛋白分析技术，对红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制进行初步探索。
iTRAQ技术已成为一种高通量、高灵敏度的蛋白质组学研究方法。
通过对样品进行同位素标记，iTRAQ可以同时比较多个样本之间的蛋白质表达差异，从而揭示蛋白质在生物过程中的作用。
在本研究中，我们利用iTRAQ技术对红参粉处理后的果蝇蛋白质组进行了深度挖掘，以探讨红参粉对果蝇抗衰老作用的可能机制。
红参粉处理后的果蝇在衰老过程中，其体内多种抗氧化酶活力显著提高，且丙二醛含量、过氧化氢含量均有所降低，提示红参粉可能通过清除自由基、减轻氧化应激损伤来发挥抗衰老作用。
红参粉处理后的果蝇体内相关抗氧化基因的表达水平也发生了一定程度的改变，进一步证实了红参粉对果蝇抗氧化能力的提升作用。
除了抗氧化能力外，红参粉还可能通过调节果蝇体内的能量代谢、炎症反应等途径发挥抗衰老作用。
红参粉处理后的果蝇在衰老过程中，其体内能量代谢相关基因的表达水平发生调整，有助于维持果蝇体内能量的稳定。
红参粉还能够抑制果蝇体内炎症因子的释放，减轻炎症反应对果蝇细胞的损伤。
本研究表明红参粉可能通过多种途径发挥抗衰老作用，其机制可能与提高果蝇体内的抗氧化能力、调节能量代谢和炎症反应等相关。
红参粉在抗衰老方面的具体作用机制仍需进一步深入研究。
我们将继续利用iTRAQ技术对红参粉处理后的果蝇进行更全面的蛋白质组学分析，以期揭示更多关于红参粉抗衰老作用机制的细节。
1. 红参粉的来源与特点红参，作为人参的一种炮制加工品，因其独特的药用价值和丰富的营养价值备受关注。
红参通常选用优质的人参，在经过严格的水分、温度控制以及炮制工艺下制成。
在人参的药用功效中，红参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血等作用。
itraq蛋白质组学样品制备
itraq蛋白质组学样品制备iTRAQ蛋白质组学样品制备蛋白质组学是一种研究生物体内所有蛋白质的整体组成、结构和功能的科学方法。
而iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification）技术是一种常用的蛋白质组学分析方法，它通过标记蛋白质样品中的肽段，实现对蛋白质的定量分析。
在进行iTRAQ蛋白质组学样品制备时，需要经过一系列的步骤。
首先，收集需要研究的生物样品，例如细胞、组织或血清。
然后，将样品进行样品裂解，以释放细胞或组织中的蛋白质。
样品裂解可以通过机械破碎、超声波处理或化学方法实现。
接下来，需要对裂解的样品进行蛋白质提取。
蛋白质提取方法有很多种，常用的包括酸性沉淀法、有机溶剂法和离子交换法等。
选择合适的提取方法可以保证蛋白质的高纯度和高稳定性。
蛋白质提取完成后，需要对提取的蛋白质样品进行消化。
消化是将蛋白质分解为肽段的过程，常用的酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。
消化的时间和酶的用量需要进行优化，以确保得到适量的肽段。
在消化完成后，需要对肽段进行iTRAQ标记。
iTRAQ标记是将肽段与特定的化学试剂结合，以实现对不同样品的定量分析。
iTRAQ试剂通常具有相同的质量，但具有不同的质谱特征，因此可以通过质谱分析来区分不同样品中的肽段。
标记完成后，需要将不同样品的标记肽段混合在一起，进行液相色谱-质谱联用分析。
液相色谱-质谱联用技术可以对肽段进行分离和鉴定，从而实现对蛋白质的定量分析。
需要对液相色谱-质谱联用分析得到的数据进行解析和统计分析。
通过比较不同样品中的肽段的相对丰度，可以获得蛋白质在不同样品中的定量信息。
这些定量信息可以用于研究蛋白质的表达差异和功能变化。
总结起来，iTRAQ蛋白质组学样品制备是一个复杂而关键的过程，它涉及到样品裂解、蛋白质提取、消化、iTRAQ标记、液相色谱-质谱联用分析和数据解析等多个步骤。
只有经过严格和准确的样品制备，才能得到可靠和有效的蛋白质组学数据，为后续的研究提供有力支持。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
案例2。蜂王浆提取物对肿瘤细胞的影响
实验背景：客户把从蜂王浆中提取到的一种化合物与人
的肿瘤细胞共同培养，观察到其抑制了肿瘤细胞的迁移 标记
侵袭能力。由此猜想，此化合物有抑制肿瘤生长的作用。 113
实验设计：对照组（2重复），模型组（3重复），给药 114
组（3重复）
115
实验过程：8组样本分别提取总蛋白定量，酶切后标记混
样品组 实验组1（对照） 实验组1（对照） 实验组2 实验组2 实验组2 实验组3 实验组3 实验组3
数据分析
采用DAVID在线工具对显著差异表达蛋白 进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分 析。（PAHTWAY无显著富集）
客户关注的信号通路（pathway）
差异表达蛋白相互作用网络分析
NCBI截止现在为1773篇
4
相关杂志对重复性要求
5
建议
※首选2-3次生物重复，最好3次或以上 组内样品个体差异大的材料需要更多的生物重复 生物学重复样品较多时，可以适当混合以减少样品数目 无任何重复，可以结合其他技术进行验证
6
iTRAQ试剂标记原理
➢ 报告部分共有8种：质量数分别为114~121Da，因此iTRAQ最多可同时 标记8组样品（客户可按需选择标记个数）。 ➢ 肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部 分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。 ➢ 平衡部分：质量数分别为31~24Da，与报告部分相互配合，保证 iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。
图1 iTRAQ技术原理图
iTRAQ技术优势
➢ 灵敏度高：可检测出低丰度蛋白； ➢ 分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶
性蛋白等； ➢ 适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和
胞外蛋白等。 ➢ 高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自
iTRAQ定量蛋白质组学
主要内容
iTRAQ技术简介 iTRAQ试剂标记原理 iTRAQ技术优势 iTRAQ实验流程 iTRAQ实验结果示例 iTRAQ实验详细步骤
iTRAQ技术简介
iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量 (isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。
3：各组样本的肽段混合物分别 用不同的iTRAQ试剂标记；
4：等量混合各样本中的标记肽 段；
5：MS/MS质谱检测及分析。
iTRAQ实验结果示例
1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶 酶切；
2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标 记 (例如对照组用iTRAQ 117标记， 其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；
3. 标记好的各组样本等量混合，液 相分离和质谱分析.
4: 不同样本中蛋白质的差异表达可 通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积 确定，如图所示：与对照组相比， 该蛋白在3个处理组(114-116)中的 相对表达量较高。
5. 根据该肽段的二级质谱峰图， 结合数据库检索，得到蛋白的定 性信息。
案例1：人脑脊液（客户文章未发表，资料 仅供内部参考）
多个处理时间的样本的差异蛋白分析； ➢ 结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、
分子量和丰富的结构信息； ➢ 自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
iTRAQ实验流程
iTRAQ实验流程。 1：收集不同组别的样本并分别
提取蛋白质；
2：蛋白质经过还原，封闭后用 胰蛋白酶酶切；
结果
4列样本共鉴定到861个蛋白，其中ELISA检测到的细胞因子也得到 验证
4组结果两两比较，筛选1.2倍以上差异，
数据分析
数据交盖图
数据分析
GO 富集分析 通过生物信息学分析工具DAVID对鉴定蛋白进行GO（Gene
Ontology，详细信息见网站：）功能 注释、功能富集分析及定位分析。（可按照客户要求绘制饼图等）
实验设计：
1.客户用ELISA方法检测正常人与病患脑脊液 中几个细胞因子存在稳定差异
2.客户提供4种不同患者脑脊液样本进行 iTRAQ检测分析。
3.首先对其中一例样本进行SDS分析，可见脑 脊液中存在高峰度蛋白。
4.除去高峰度部分蛋白，其他条带切胶合并酶 切提取。（也可以使用商品化去除高峰度试 剂盒，成本较高，效果也因人而异。）
合。之后进行液相粗分离，最后QE质谱检测。
116
实验结果：蛋白序列数据库来源: 人类UniProt数据库。 117 质谱数据搜索采用PD搜索引擎共鉴定到蛋白4565个。差 118
异蛋白分组进行比较。（判断实验成功与否的标准为鉴 119
定到的总蛋白数是否达到文献水平，差异蛋白数与实验 121 设计相关，无法承诺。）
利用MetaCore软件，对所有显 著差异表达蛋白进行相互作用 网络分析，。相互作用网络分 析显示，差异表达蛋白富集到 30条经典子网络，右为包含 “SP1, TRAP230, Neprilysin, MIF, SLC38A2”等关键节点的子 网。
数据分析
数据分析
Pathway通路富集分析
在生物体内，存在着大量的代谢、调控和信号转导过程，这些过程往往形成一条条 不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解发生差异变化蛋白质所的 生物学进程位置。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库（Kanehisa，2008）， 通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。
iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连 接的胺标记同重元素。在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同 样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。
在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰；
在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离 子表现为不同质荷比(114～121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可 以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果 结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。