同位素标记方法蛋白质组学
比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术
进展评述比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术刘新1,2 应万涛1,2 钱小红1,23(1军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850;2北京蛋白质组研究中心 北京 102206)摘 要 比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。
近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。
比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。
关键词 比较蛋白质组学 稳定同位素标记 体内代谢标记 体外化学标记Application of Stable Isotope Labeling in Comparative ProteomicsLiu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23(1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850;2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206)Abstract C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics.K ey w ords C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来.1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。
技术与方法定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志
技术与方法定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):56～61叶雯刘凯于洪华珠*刘丽君（华中师范大学教育部农药与化学生物学重点实验室武汉430079）摘要定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物科学研究的重要内容。
近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就,但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。
该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或肽段，同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。
在此基础上，实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。
综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。
关键词同位素标记翻译后修饰定量蛋白质组学收稿日期：20050307修回日期：20050921*通讯作者，电子信箱：hzhong@随着多个物种基因组测序的完成，人们逐渐认识到单纯从基因组信息并不能完全揭示生命活动的规律。
基因在转录、翻译后产生蛋白质的过程中，存在着转录水平、翻译水平的调控，同时还存在着蛋白质的翻译后修饰，而且不同组织、不同的分化程度，在不同的环境下，生物体所表达的蛋白质是不同的。
因此，蛋白质组学应运而生，其核心在于系统地识别一个细胞或组织中表达的每一种蛋白质。
定量蛋白质组学就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。
目前，对复杂体系中的蛋白质进行定量主要有两种方法［1］：（1）结合2 DE和质谱（mass spectrometry,MS）技术及蛋白质数据信息技术对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。
（2）基于稳定同位素标签和液相色谱与质谱联用技术(LC MS/MS)鉴定和定量蛋白质。
SILAC蛋白组
SILAC蛋白组
SILAC蛋白组或SILAC定量蛋白组学，是指利用SILAC技术对蛋白质组进行定量研究。
百泰派克生物科技提供基于SILAC标记的定量蛋白组分析服务。
SILAC
在基于质谱(MS)的定量蛋白质组学中，SILAC（Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture）是通过在细胞培养过程中加入稳定同位素标记的
氨基酸对样品进行标记后结合质谱检测，对样品进行蛋白质组学分析的方式是一种简单、可靠而又强大的方法。
SILAC通过正常代谢过程对细胞蛋白进行标记，在新
合成的蛋白质中加入非放射性的、稳定的含同位素的氨基酸。
SILAC提供了准确的
相对定量，不需要任何化学衍生或操作，即可实现蛋白质组学分析。
SILAC属于体
内标记技术，使样品更接近自然状态，其标记效率高达100%，且标记效果稳定，
适合于全细胞蛋白分析，以及膜蛋白的鉴定和定量，每个样本只需要几十微克的蛋白量。
SILAC蛋白组分析
SILAC定量蛋白组分析的实验流程是：在细胞培养基中加入轻、中或重型稳定同位
素标记的必需氨基酸赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，在细胞生长过程中，新合成的蛋白质带上稳定同位素标签。
培养一段时间后，等量混合细胞培养物中各类型蛋白质，酶解后进行质谱分析。
由于质量差异，可以在质谱仪中区分带有不同稳定同位素组成的化学性质相同的肽对。
通过比较一级质谱图中不带标记和带同位素标记的质谱峰型的面积大小即可进行相对定量，同时二级谱图还可以对肽段进行序列测定从而进行蛋白鉴定。
SILAC蛋白组。
同位素标记结合免疫印迹-化学发光法鉴定小鼠神经元磷酸化蛋白质组
同位素标记结合免疫印迹-化学发光法鉴定小鼠神经元磷酸化蛋白质组姚富丽;李洪;尹康;何涛;吴民泸;肖斌【期刊名称】《生物医学工程学杂志》【年(卷),期】2007(24)4【摘要】创建一套简单、实用、灵敏、高效的分析鉴定磷酸化蛋白质组的优化方案。
采用同位素标记、双向电泳、放射自显影等技术建立小鼠神经元磷酸化蛋白质组图谱,再用免疫印迹-持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元磷酸化蛋白质——PI3Kr3、MEK1、PKCα。
结果显示三种磷酸化蛋白质在双向电泳放射自显影图谱和双向电泳免疫印迹-化学发光图谱上的斑点基本匹配,提示本研究建立的以同位素标记和免疫印迹-化学发光法为核心的分析鉴定磷酸化蛋白质组的一整套优化方案灵敏度高、特异性强。
【总页数】4页(P898-901)【关键词】同位素标记;双向电泳;免疫印迹;化学发光;磷酸化蛋白质组【作者】姚富丽;李洪;尹康;何涛;吴民泸;肖斌【作者单位】泸州医学院基础医学院生物化学教研室;泸州医学院附属医院外总教研室;泸州医学院科研处【正文语种】中文【中图分类】R339.21【相关文献】1.磷酸化蛋白质组学鉴定 PTPLAD1调控的结肠癌细胞酪氨酸磷酸化蛋白质 [J],胡阳;杨杰;余汝媛;汪洋2.等电聚焦分离与18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究 [J], 隋少卉;王京兰;贾伟;卢庄;刘金风;宋丽娜;蔡耘;钱小红3.小鼠饲养过程中蛋白质组的整体重稳定性同位素标记 [J], 樊锋旭;高慧英;徐忠伟;翟琳辉;衣泰龙;张涛;吴飞林;崔春萍;徐平4.小鼠肝脏磷酸化蛋白质组鉴定及磷酸化修饰激酶的分析 [J], 林丛;任亮亮;姜颖;贺福初;5.小鼠肝脏磷酸化蛋白质组鉴定及磷酸化修饰激酶的分析 [J], 林丛;任亮亮;姜颖;贺福初因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蛋白质组学实验
方向。
药物研发
药物作用机制研究
蛋白质组学实验能够揭示药物对蛋白质表达的影响，深入了解药 物的作用机制。
药物筛选
蛋白质组学实验可用于高通量药物筛选，提高药物研发效率。
个体化用药
通过蛋白质组学实验，可以评估个体对药物的反应差异，实现个 体化用药。
生物标志物发现
疾病生物标志物
蛋白质组学实验能够发现与疾病相关的生物标志物，用于疾病的监 测和预后评估。
串联质谱
结合质谱分析和电泳技术， 用于鉴定低丰度蛋白质和 复杂蛋白质混合物。
蛋白质定量技术
同位素标记法
通过同位素标记目标蛋白质，利用质谱技术进行相对 定量。
荧光染料标记法
利用荧光染料标记目标蛋白质，通过荧光检测进行定 量分析。
稳定同位素标记法
通过稳定同位素标记目标蛋白质，结合质谱技术进行 绝对定量。
疏水相互作用色谱
通过蛋白质的疏水性差异 分离蛋白质，常用于蛋白 质的初步分离。
离子交换色谱
利用蛋白质的离子性质差 异进行分离，适用于去除 杂质和浓缩蛋白质。
蛋白质鉴定技术
免疫印迹
利用特异性抗体检测目标 蛋白质，常用于蛋白质的 定性分析。
质谱分析
通过测定蛋白质的氨基酸 序列和修饰，对蛋白质进 行精确鉴定。
蛋白质组学实验
• 引言 • 蛋白质组学实验技术 • 蛋白质组学实验流程 • 蛋白质组学实验的应用 • 蛋白质组学实验的挑战与展望 • 参考文献
01
引言
蛋白质组学简介
蛋白质组学是研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、表达和功能的一门科学。 它与基因组学、转录组学一起，构成了系统生物学的重要组成部分。
质谱分析
对肽段进行质谱分析，测定其分子量和序列 信息。
蛋白组学
MS（mass spectrum）质谱法：一种测量离子质荷比的分析方法tamdam-MS 串联质谱：将两个或更多质谱连接在一起。
MALDI（Matrix-Assisted laser Desrption Ionization）基质辅助激光解吸电离离子源：用激光照射样品与基质形成的光结晶薄膜、基质从激光中吸收能量传递到生物分子，而电解过程中将质子转移到生物分子或生物分子得到质子而使生物分子电离的过程ESI（Electron spray Ionization）点喷雾离子源：属于一种软电离源，能使大质量的有机分子生成多电荷的离子。
2D-DIGE（two dimension difference gel electrophoresis）一种新的荧光标记的定量蛋白质组学技术。
利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像。
zoom gel 变焦镜头凝胶成像：利用百变焦镜头的设备对凝胶进行拍摄成像。
two-in-one-gel 二合一凝胶：将相同PH范围胶条一起进行SDS-PAGE的技术SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell culture）细胞培养下稳定同位素标记技术）：是在细胞培养过程中，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白表达进行定量分析的技术。
CDIT（charge detection ion trap）电荷检测离子阱：一种将离子通过电磁场限定在有限空间内的设备，用于多级质谱分析。
ICAT（Isotope Coded Affinity Taq）同位素亲和标签技术:用具有不同质量同位素亲和标签标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术对混合样品进行质谱分析。
iTRAQ（isobaric taqs fur relative and absolute guentitation）同位素标记相对和绝对定量技术：该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪分析，可同时比较8种样品间蛋白表达量。
同位素标记技术在代谢组学中的应用
同位素标记技术在代谢组学中的应用同位素标记技术是一种利用同位素标记分子进行代谢研究的方法。
在代谢组学研究中，同位素标记技术被广泛应用于代谢轨迹分析、代谢动力学研究和代谢物定量等领域，在深入理解生物体代谢网络和寻找代谢性疾病新治疗靶点方面发挥着至关重要的作用。
同位素标记技术的基本原理是利用稳定同位素（一般是碳、氮、氢等）替代分子中的天然同位素来标记代谢物。
常用的同位素标记剂包括13C、15N和2H等。
通过给细胞或生物体输入同位素标记剂，可以改变代谢物分子的质量，从而实现对代谢反应的追踪和定量。
在代谢组学研究中，同位素标记技术可以提供丰富的代谢信息，帮助研究人员了解代谢路径的运行方式、代谢途径的互联关系以及代谢物之间的转化过程。
首先，同位素标记技术在代谢轨迹分析中发挥着重要作用。
代谢轨迹分析是研究某一特定代谢物在代谢途径中的转化过程的重要手段。
使用同位素标记技术可以追踪代谢物在代谢途径中的交换和转化过程。
例如，通过给细胞培养基添加13C标记的葡萄糖，可以追踪葡萄糖在糖酵解和三羧酸循环中的转化过程，从而揭示其中的代谢路径和关键酶的活性变化。
同位素标记技术的高灵敏度和高特异性使得代谢轨迹分析更加准确和可靠。
其次，同位素标记技术在代谢动力学研究中也得到广泛应用。
代谢动力学研究关注的是代谢反应的速率和动力学参数。
使用同位素标记技术可以通过分析同位素标记代谢物的时间曲线来确定代谢反应速率常数和反应通量。
例如，通过给实验动物静脉注射15N标记的氨基酸，可以追踪氨基酸在蛋白质代谢过程中的转化速率，了解蛋白质合成和降解的速率及平衡动力学。
同位素标记技术的高灵敏度和高时空分辨率使得代谢动力学研究更加精细和深入。
此外，同位素标记技术还在代谢物定量分析中发挥着关键作用。
通过给细胞或生物体输入已知浓度的同位素标记物，可以实现对代谢物的定量分析。
同位素标记物和待测样品中的代谢物混合后，通过质谱或核磁共振等分析技术，对同位素标记物和代谢物进行定量测定。
同位素亲和标签技术
三、ICAT原理
利用同位素亲和标签试剂预先选择性地标记含半胱氨酸的肽类， 分离纯化后通过质谱进行鉴定，根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一 对肽段离子的强度比例，定量分析它的母本蛋白质在原来细胞中的相 对丰度。
当对两种蛋白质样品进行比较分析时,分别加入轻型和重型ICAT 试剂,待反应完后将两种样品等量混合,TPCK-胰蛋白酶水解,过生物素 亲和层析柱分离,ICAT标记的肽片断吸附在柱上,然后洗脱进行液相色 谱-质谱分析。不同来源的同种多肽会成对并相邻地出现在质谱图上, 且分子量差值为8u或4u (若肽段带2个电荷),两者峰面积的差别即为 两样品中同一种蛋白质表达的差异。
二、ICAT的发展
同位素亲和标签技术（isotopecoded affinity tag,ICAT） 最先由Steven P. Gygi等于1999年提出。
Gygi首次用ICAT试剂对在不同碳源生长条件下的酵母细胞蛋白质 表达水平上的差异进行了定量比较,并对该方法的方法学进行了确证.
(Gygi S P, Rist B, Gerber S A, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotech, 1999, 17(10):994-999)
I
3.1、ICAT结构
HS-CH2-CH-COO+NH 3
半胱氨酸
反应
三部分：化学反应基团（与蛋白质半胱氨酸残基SH专一反应；中间连接子（结合 稳定同位素）；亲和反应基团（一种生物素亲和标签，与生物素结合选择分离ICAT标 记的多肽）。试剂分为两种形式，连接子含有8个氘原子为“重型”，含有8个氢原子 为“轻型”，这两种形式的ICAT试剂质量相差8D（肽段带两个电荷时相差4D）。
多组学研究-蛋白质组与代谢组,看这个就够了
一、概要在静态基因组碱基测序完成之后，系统生物学已经进入了后基因组学时代，蛋白质组学等功能基因学和代谢组学的研究目前已成为系统生物学研究的重点。
蛋白质组学研究是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，同时也是功能基因组时代生命科学研究的核心内容之一，而代谢组学的研究越来越多，在发现生物标志物方面发挥了重要作用。
二、蛋白质组学介绍蛋白质组学(Proteomics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的学科。
目前蛋白质组学的研究主要有两条路线：一是基于双向电泳的蛋白质组学；二是基于质谱的蛋白质组学。
目前基于质谱的蛋白质组学研究也越来越广泛。
定量蛋白质组根据是否对目标蛋白进行定量，基于质谱的蛋白质组学定量技术可分为非靶向定量蛋白质组学（Untargeted quantitative proteomics）和靶向定量蛋白质组学（Targeted quantitative proteomics），其中靶向定量技术包括多重反应监测技术（Multiple reaction monitoring，MRM）和平行反应监测（Parallel reaction monitoring，PRM），非靶向定量技术包括非标记定量和稳定同位素标记定量，稳定同位素标记又可分为多种模式，最值得关注的是等重同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）和串联质量标签（Tandem mass tags，TMT）技术。
目前质谱定量技术主要采取数据依赖采集模式（Data dependent analysis，DDA），新发展的数据非依赖采集模式（Data independent analysis，DIA）。
DIA具有更好的分析准确度和动态范围，也值得重点关注。
不同定量方式对比应用优势PRM目标蛋白定量及验证靶向性检测灵敏度高DDA 非标记单样本上机价格低应用范围广DIA/SWATH 非标记大规模定量灵敏度高；通量大SILAC 体内标记多样本上机传代细胞检测定量准确重复性好标记不受裂解液成分影响iTRAQ/TMT 体外标记多样本上机定量准确重复性好蛋白质组学常见分析内容分析项目分析内容质控肽段长度分布、定量分布、肽段质量误差分布注释蛋白功能描述、GO注释、KEGG代谢通路功能分类GO二级功能分类功能富集GO功能富集、代谢通路富集蛋白网络分析蛋白网络互作分析通路分析代谢通路图进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。
简述定量蛋白质组学技术
定量蛋白质组（quantitative proteomics）是把一个基因组所表达的全部蛋白或者是一个复杂体系所有的全部蛋白进行鉴定和定量的方法。
蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程都有重要影响。
例如在许多疾病的发生和发展进程中，常常伴随着某些蛋白质的表达异常。
发展至今，传统的基于双向电泳的2D和2D-DIGE技术正在逐渐被基于NanoLC-MS/MS的液质联用技术取代；后者需要的样品量更少（25ug蛋白），灵敏度更高（ng级），通量也更高（一次分析可以鉴定和定量超过5000种蛋白）。
定量蛋白质组学常见技术如iTRAQ/TMT、Label Free、三类定量方法，百泰派克均可为您提供服务。
在这里我们给大家简要介绍一下这三种定量蛋白质组学方法：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术分别由美国AB Sciex公司和Thermo Fisher公司研发的多肽体外标记定量技术。
该技术采用多个（2-10）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团进行串联质谱分析，能够同时比较多达10种不同样本中蛋白质的相对含量，可用于研究不同病理条件下或者不同发育阶段的组织样品中蛋白质表达水平的差异。
分析原理iTRAQ/TMT标签包括三部分，如下图：1. 报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平。
2. 平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的同一肽段m/z相同。
3. 肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段。
来自不同样品的同一肽段经试剂标记后具有相同的质量数，并在一级质谱检测（MS1）中表现为同一个质谱峰。
当此质谱峰被选定进行碎裂后，在二级质谱检测（MS2）中，不同的报告基团被释放，它们各自的质谱峰的信号强弱，代表着来源于不同样品的该肽段及其所对应的蛋白的表达量的高低。
18 O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化
６／ 成对肽段峰强度 的动态范围及定量准确度进行 了考察 。结果表 明， 标记 方法 是一种简便 、 ０／ 稳定 、 可靠
的相对定量方法 ，０倍动态范围内， １ 标记率相对标 准偏 差在 １． ％以内 ，０ ８４ ／ Ｏ峰强度呈 很好的线性关 系。本 ６
实验考察了标记后的肽段 在不 同溶液体系中的稳定性 ， 为复杂样 品的预处理和预分离的溶液条件提供了依据 。
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第３ ５卷
２０ ０ ７年 ２ 月
分 析 化 学 （ Ｅ Ｘ Ｕ Ｘ Ｅ 研 究 报 告 ＦＮ Ｉ Ａ Ｕ ） Ｈ
Ｃ ｉ ｅ ｅＪ ｕ ａ ｆＡｎ ｌ ｔ ａ ｈ ｍｉｔ ｈ ｎ ｓ ｏ ｒ ｌ ａｙ ｉ ｌＣ ｅ ｓｒ ｎ ｏ ｃ ｙ
关键词 稳定 同位素标记 ，（， ）定量蛋 白质组学 ， ８ 质谱 ， 液相色谱
１ 引 言
依 靠 ２Ｄ 、 维 色谱 和 串联 质 谱 技 术 ， 白质 组研 究 策 略 在 细 胞 蛋 白质 的 鉴 定 上 已经 比较成 熟 。 －Ｅ多 蛋 但 要弄 清 细胞 内的各 种生 物反 应过 程 ， 以及蛋 白质 的表 达 与这些 反应 过程 的关 联 ， 仅 提供一 个蛋 白质 仅 鉴定 列表 是不 够 的 ， 还要 求 对蛋 白质 的表 达进 行定 量描 述 ， 因此 ， 量蛋 白质 组 学 的研 究 应运 而 生 。 当 定 前 ， 白质组研 究 中 比较成 熟 和可靠 的定量 研究 策 略主要 有两 种 ： １ 以凝胶 电泳 为基 础 的染 色 分析 方 蛋 （） 法 ， 过 比较成 对样 本 中的蛋 白质 在 不同胶 上 的染 色强度来 进行 相 对 定量 ；２ 利用 稳 定 同位 素标 记 和 通 （） 质 谱检 测结 合来 定量 ， 这需 要 对来 自不 同生 理病 理条 件 的蛋 白质 或 肽段 标 记 上 结构 相 同而 同位 素 质 量
同位素标记法
同位素标记法同位素用于追踪物质运行和变化过程时，叫示踪元素，用示踪元素标记的化合物，其化学性质不变。
人们根据这种化合物的放射性，对生物体内各种复杂的生理、生化过程进行追踪，这种科学研究方法就叫做同位素示踪法。
在生物学科中，经常利用14C、18O、15N、3H、32P和35S等同位素作为示踪原子，来考察学生分析、判断和推断能力。
同位素示踪法是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，即把放射性同位素的原子参到其他物质中去，让它们一起运动、迁移，再用放射性探测仪器进行追踪，就可知道放射性原子通过什么路径，运动到哪里了，是怎样分布的。
1．放射性同位素示踪法的特点：①灵敏度高、②方法简便、③定位定量准确、④符合生理条件2．各种同位素及其在中学生物学中的应用⑴氢的同位素已知氢有三种同位素，即氕、氘和氚，氕和氘是稳定的同位素，而氚具有放射性，能够发射负B射线，因而可以通过探测器进行追踪。
3H 标记化合物是指用放射性3H取代化合物中的稳定同位素氕或氘，并以3H作为标记的放射性标记化合物。
例如，在介绍科学家在研究分泌蛋白的合成和分泌时，曾经做过这样一个实验：他们在豚鼠的胰脏腺泡细胞中注射3H标记的亮氨酸，3min后，被标记的氨基酸出现在附着有核酸体的内质网中，17rain后，出现在高尔基体中，117min后，出现在靠近细胞膜内侧的运输蛋白质的小泡中，以及释放到细胞外的分泌物中，这个实验说明分泌蛋白在附着于内质网上的核糖体中合成之后，是按照内质网叶高尔基体一细胞膜的方向运输的，从而证明了细胞内的各种生物膜在功能上是紧密联系的。
⑵碳的同位素自然界中碳元素有三种同位素，即稳定同位素12C、13C和放射性同位素14C。
14C能够发射B射线，因此可以用放射性14C取代化合物中它的稳定同位素12C，并以14C作为标记的放射性标记化合物。
例如教材中介绍了科学家用含有14C的二氧化碳来追踪光合作用中的C原子的转移途径是：二氧化碳一→三碳化合物一→糖类。
用于质谱的氨基和羧基同位素标记试剂及其应用
用于质谱的氨基和羧基同位素标记试剂及其应用
氨基和羧基同位素标记试剂在质谱分析中具有广泛的应用。
氨基和羧基同位素标记试剂通过将特定同位素的标记基团引入分子中，可以用于研究生物分子的代谢途径、蛋白质的结构与动态变化以及药物的代谢和药效评价等方面。
常用的氨基和羧基同位素标记试剂包括氨基和羧基同位素标记的荧光染料、放射性同位素标记试剂以及质谱内标标记试剂等。
氨基和羧基同位素标记试剂在质谱分析中的应用主要包括：
1. 代谢组学研究：氨基和羧基同位素标记试剂可以用于研究生物体内代谢物的来源、转化途径和代谢速率。
通过将稳定同位素标记的底物或药物输入生物体，再利用质谱技术测定其代谢产物中同位素标记的比例变化，可以推断代谢途径和代谢酶的活性。
2. 蛋白质组学研究：氨基和羧基同位素标记试剂可以用于研究蛋白质的结构和动态变化。
例如，通过将氨基或羧基中的氢原子替换为稳定同位素氘或碳-13，可以利用质谱技术定量测定
蛋白质的合成速率、降解速率、修饰反应等，从而深入理解蛋白质的功能和调控机制。
3. 药物代谢研究：氨基和羧基同位素标记试剂可以用于研究药物的代谢途径、代谢产物和代谢酶。
通过将药物的氨基或羧基中的氢原子替换为稳定同位素，可以准确测定药物的代谢产物中同位素标记的比例变化，从而筛选药物代谢途径和评估药物
代谢能力。
总之，氨基和羧基同位素标记试剂在质谱分析中的应用非常广泛，能够提供准确、灵敏和可靠的分析结果，为生物医学研究和药物开发提供重要支持。
串联质谱标签蛋白质组学
串联质谱标签蛋白质组学质谱标签蛋白质组学是一种用于研究蛋白质组的高通量技术，它能够帮助科学家们更好地理解蛋白质在细胞内的功能和相互作用。
本文将重点介绍质谱标签蛋白质组学的原理、方法和应用，并讨论它在生命科学研究中的潜在作用。
质谱标签蛋白质组学是通过以质谱为基础的方法来描述和研究蛋白质组的技术。
在这项技术中，蛋白质通常会被加上一种特定的化学标签，使其具有质谱特性，然后通过质谱仪进行检测和分析。
这种标签可以是化学试剂、同位素或者蛋白质交联剂，它们能够帮助科学家们更容易地检测和识别蛋白质，从而实现对蛋白质组的全面分析。
在质谱标签蛋白质组学中，常用的标记方法包括荧光标记、同位素标记和蛋白质交联标记。
荧光标记是将蛋白质与荧光染料结合，使其具有发光特性，从而可以通过荧光检测技术进行分析。
同位素标记则是将样品中的蛋白质与不同的同位素标记结合，通过质谱仪来检测同位素标记的蛋白质，从而实现定量分析。
蛋白质交联标记则是将蛋白质中的氨基酸残基进行交联，从而形成蛋白质交联产物，通过质谱仪进行检测和分析。
质谱标签蛋白质组学技术的应用非常广泛，在蛋白质组学、蛋白质相互作用、蛋白质修饰和蛋白质结构研究等领域都有着重要的作用。
比如在疾病的诊断和治疗中，科学家们可以利用质谱标签蛋白质组学技术来分析疾病相关蛋白质的表达和修饰情况，以期找到新的诊断标志物和治疗靶点。
在药物研发领域，质谱标签蛋白质组学技术也可以帮助科学家们更好地理解药物与蛋白质的相互作用，从而设计更有效的药物。
除此之外，质谱标签蛋白质组学技术还可以应用于农业、食品安全和环境监测等领域。
在农业方面，科学家们可以利用该技术来研究作物的生长发育过程和抗逆能力，以期开发更具抗逆性和产量的作物品种。
在食品安全方面，质谱标签蛋白质组学技术也可以帮助监测食品中的有害物质和添加剂，保障食品的安全和质量。
在环境监测方面，科学家们可以利用该技术来分析环境中的污染物和有害物质，从而更好地保护环境。
氮15同位素标记应用
氮15同位素标记应用一、同位素标记工作原理同位素标记法的原理是基于同位素具有相同原子数、但不同中子数的元素的同种元素。
当同位素被用作标记时，它们可以被追踪和分离，从而允许跟踪化合物的转化，了解反应和生物过程的机制。
同位素标记法是一种通过化学反应、代谢通路或细胞来跟踪同位素(具有相同质子数，不同中子数的同一元素的原子)的技术。
将反应物中某些特定原子用其同位素替换（“标记”），然后让反应物进行反应。
通过监测同位素在产物中的位置，以确定同位素原子在化学反应或细胞代谢途径中遵循的规则。
同位素标记中使用的核素可以是稳定核素或放射性核素。
在后一种情况下，标记被称为放射性标记。
在同位素标记中，有多种方法来检测标记同位素的存在：质量、振动模式或放射性衰变。
质谱检测同位素质量的差异，红外光谱检测同位素振动模式的差异，核磁共振检测具有不同旋磁比的原子。
放射性衰变可以通过电离室或凝胶放射自显影来检测。
二、氮15稳定同位素种类氮15稳定同位素种类三、主要应用场景氮15稳定同位素广泛应用于生物医学、化学分析、农业研究等行业作为常规应用的示踪剂，具有安全、可靠、实用、准确等特点。
随着稳定同位素分离分析技术的不断发展和突破,稳定同位素标记化合物的种类将继续增加，应用范围也将继续扩大。
常见的应用领域包括：常见应用场景其中，氮15 稳定同位素在土壤肥料研究中的应用，因为它没有放射性，不需要特殊保护，它可以在作物的整个生长期进行试验。
此外,几乎所有的氮肥都可以通过 氮15 N稳定同位素标记化合物作为示踪剂，可用于研究氮肥的位置、氮肥利用效率和土壤氮素转化的影响因素，以提高农作物的产量。
而在农业施肥中，通过研究有机肥与无机肥的分别施用或相互施用的问题，以达到解决这个问题的目的。
15 稳定同位素标记化合物作为示踪剂。
根据不同的作物、不同的氮肥、不同的生态条件和不同的施肥方法，研究合理施肥和提高土壤肥力的方法，以确定最佳施肥策略。
在生物固氮研究应用技术中，氮 15 稳定同位素标记化合物作为示踪剂也被广泛应用于生物固氮研究。
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15
优点： 15 高效性： N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%； 重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； 15 灵活性：在培养基中添加同位素标记 N ，操作方便。
缺点： 14 15 （1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对 N/ N标记的蛋白质或肽段的相应质 量位移进行预测。 15 14 15 （2）由于使用的 N培养基纯度>96%，无法完全置换 N,所以 N标记的肽段在质谱中 会有额外的同位素峰。
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代谢标记法—SILAC
简介：
SILAC即细胞培养条件下 稳定同位素标记技术，在细胞 培养时，采用含有轻、中、重 同位素型必需氨基酸的培养基 进行细胞培养，细胞经传代培 养若干代后，蛋白质将被同位 素稳定标记，等量混合标记的 蛋白质后分离和质谱鉴定，根 据一级质谱图中三个同位素型 肽段的面积比较进行相对定量 和二级谱图对肽段进行序列测 定从而鉴定蛋白质。
稳定同位素标记
代谢标记法：
15
在培养基中添加 N或其他同位 15 2 素氨基酸（ C或 H)的氨基酸，细胞 经过若干代培养后，蛋白质将完全被 同位素标记，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。
化学标记法：
在收集蛋白质样品后，利用化学 反应在蛋白质或肽段的特殊位点引入 同位素标签，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。
常见的同位素标记技术
代谢标记法：
（1）15N标记法 （2）细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC)
化学标记法：
（1）ICAT法 （2）iTRAQ法
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代谢标记法— N标记法
简介： 15 在培养基中添加 N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混 合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根 据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。
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化学标记法—iTRAQ
简介：
iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图 中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱 中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以 鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。
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代谢标记法—SILAC
技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法
（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测 测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞 或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两 种氨基酸，操作方便。
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代谢标记法—SILAC Labelin corporation
随着细胞培养的传代，细胞种原有的”轻“型蛋白质逐渐被”重“型蛋白质蛋白质代替
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化学标记法—iTRAQ
iTRAQ技术服务流程：
iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后，提取蛋 白质; 2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋 白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ 标记; 4：等量混合各种不同iTRAQ标记好 的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。
化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修 饰物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会 造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
iTRAQ 结构
iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平 衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8 组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共 价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷 比相同。
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化学标记法—ICAT
A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘） B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。