Ⅰ一个编码木聚糖水解酶基因,OsXYN1的功能解析Ⅱ拟南芥中两个具有不同底物特异性的核苷酸转移酶共同介导m

Ⅰ一个编码木聚糖水解酶基因，OsXYN1的功能解析Ⅱ拟南芥中两个具有不同底物特异性的核苷酸转移酶共同介导microRNA降

解的研究

植物次生细胞壁主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成,对维持细胞形态,为植株提供了机械支撑和保护具有重要作用。水稻抗倒性是高产、稳产的重要遗传基础,其茎杆粗细、维管束数目和结构对抗倒性、同化产物转运效率均具有重

要意义。

因此发现和研究参与合成或降解植物细胞壁多糖分子的基因对于培育高产、

优质、抗性优良的新品种至关重要。木聚糖是植物细胞中含量第二高的多糖分子,直接影响植物的正常生长与发育。

本项目从具有茎杆粗壮、抗倒伏强等多种优良育种特性的杂交稻骨干亲本蜀

恢498的EMS突变体库中,我们发现两个茎秆明显变细,其它性状相似的突变体Osxyn1-1和Osxyn1-2。突变体表现为植株变矮、叶尖萎焉、育性降低、分蘖数

降低、维管束变窄等多种突变性状。

遗传、等位和候选基因分析表明两突变体的突变性状为同一个未报到的编码

木聚糖水解酶基因的不同位点突变导致。本研究在上述研究基础上深入研究了OsXYN1细胞和分子功能机制,包括OsXYN1的时空表达,蛋白亚细胞定位、茎秆单糖组分分析、叶片中可溶性寡聚糖分析、蛋白活性检测以及揭示基因调控网络等等,为解析水稻茎杆组织细胞生长发育的分子调控网络奠定基础,为水稻抗倒相关的分子设计育种提供理论依据。

主要实验结果如下:1)通过对农艺性状考察发现突变体与野生型相比有多个

农艺性状的改变,主要包括植株变矮、叶尖萎焉、育性降低、分蘖数减少、维管

束变窄等等。2)对野生型和突变体的叶片和茎秆部位进行细胞学分析发现突变体

叶片叶绿体结构紊乱、片状堆叠结构改变、淀粉沉积;突变体茎秆中厚壁细胞次

生细胞壁发生改变,初生壁消失。

3)基因精细定位和候选基因分析表明,位于第3染色体的LOC_OSO3G47010基因位点碱基的替换导致突变性状,该位点编码木聚糖水解酶,命名为OsXYN1。

4)不同时期不同部位的组织RT-PCR检测发现OsXYN1在各个时期的叶片中高表达,在茎秆中的表达量相对较低。

同时通过RNA原位杂交技术发现OsXYN1在茎秆维管束中也有表达。5)水稻原生质体、洋葱表皮细胞瞬时表达实验发现OsXYN1编码蛋白定位在细胞膜上。

6)GC-MS分析细胞壁中各种单糖组分的组成差异表明,OsXYN1突变体中阿拉伯糖含量降低,且相对野生型,突变体中AIR得率较低。7)通过测定叶片组织中可

溶性寡聚糖含量发现相比野生型,突变体中含有阿拉伯糖的寡聚糖含量明显下降。

8)Q-PCR检测发现与细胞壁各个组分合成相关基因在OsXYN1突变体中表达

量显著下调。综上所述,我们克隆了一个编码木聚糖内切酶基因OsXYN1,可能参

与木聚糖生物合成过程,负责木聚糖含有阿拉伯糖侧链的水解。

OsXYN1的克隆为解析水稻茎杆组织细胞生长发育的分子调控网络奠定基础,可为水稻抗倒相关的分子设计育种提供理论依据。在真核生物中含有以下三类小RNA:microRNAs(miRNAs),small interfering RNAs(siRNAs)and

piwi-interacting RNAs(piRNAs),广泛参与到多种生理代谢过程,比如生长发育、识别反应、基因组稳定以及环境适应等等。

鉴于小RNA广泛存在且不可缺少的功能,对其合成和降解的研究尤为重要。

催无论是植物中siRNA、miRNA 或者是动物中 piRNA,都由 HUAENHANCER1(HEN1)

化 3’末端核苷酸2’-O-甲基化修饰。

在拟南芥hen1突变体中,miRNAs和siRNAs在羟基端一到多个碱基被剪切且常常伴随多尿嘧啶核苷酸化,同时含量相比野生型而言也显著降低从而表现出多

种突变性状。相似的在动物体内,hen1的突变同样导致内源的piRNA和siRNA 3’末端的剪切和多尿嘧啶核苷酸化。

这些研究表明2’-O-甲基化加尾作用可以保护小RNA免于3’-5’核酸外切酶剪切作用以及核苷酸转移酶的3’端加尾作用,从而在体内维护小RNA的稳定,使其具有正常的生物功能。在先前的研究中,我们发现了拟南芥(Arabidopsis)

体内miRNA的尿嘧啶化修饰主要是由一个编码核苷酸转移酶基因催化,该基因被

。

命名为HESO1(HEN1 SUPPRESSOR1)

其功能的丧失会部分恢复由于hen1的突变而导致的一系列发育问题,而在分子水平上表现为大部分miRNA3’端尿嘧啶化加尾作用显著降低的同时,相对hen1突变体,使miRNA的含量明显上升。分别对hen1和hen1heso1体内小RNA 建库测序分析发现3’端的加尾作用和3’端的剪切作用是相互独立、互不依赖的,无论是在全长的miRNA以及3’剪切修饰的miRNA,3’端的加尾作用都有发生。

尽管heso1基因功能的丧失在一定程度上导致了3’端尿嘧啶化的显著降低,但是大部分miRNA的尿嘧啶化并没有完全消失,特别是单尿嘧啶化修饰依旧在hen1heso1双突变体中广泛存在。这就让我们提出一个假设:除HES01外,体内还存在另一个核苷酸转移酶与其共同修饰miRNA的加尾作用。

同时miRNA的尿嘧啶化是否发生在AG01复合体上(拟南芥中miRNA的主要主要效应子),以及在体内尿嘧啶化通过什么途径导致miRNA的降解等仍然是未知、有待研究的。在本研究中,我们在候选的拟南芥核苷酸转移酶十个同源基因中,

通过体内小RNA建库测序分析发现URT1,仅次于HESO1,能影响miRNA的尿嘧啶化。

体外实验证明UR和HESO1具有对miRNA底物3’端碱基有不同的偏好性,在体内能分别作用于同种miRNA不同变体形式,我们发现URT1和HESO1能相继的对一些miRNA起作用,首先URT1使miRNA单尿嘧啶化,然后单尿嘧啶化的miRNA底物进一步的被HESO1加尾;URT1和HESO1在体外都能作用于AGO1结合的miRNA,且令人感到兴奋的是与HESO1相比,在miRNA具有一定程度的加尾修饰后

(2-3nt),URT1更有效的促进miRNA从AGO1复合体上脱落的活性。我们发现对AGO1结合的miR165/6的加尾作用可以降低其剪切活性,而同时对miR171a的单尿嘧啶化修饰又赋予其激发phasiRNA生物合成的能力。

总之,对miRNA的加尾作用可以影响miRNA的生物活性同时促进其降解,该研究对理解miRNA体内平衡与降解的研究有重要意义。主要的实验结果如下(1)在拟南芥体内,通过小RNA建库测序分析发现一小部分特定的miRNA的尿嘧啶化加尾作用是由URT1编码的核苷酸转移酶负责。

(2)作用于不同形式的miR158,URT1和HESO1共同催化miR158的尿嘧啶加尾反应。(3)在体外URT1具有与HESO1相似的核苷酸转移酶活性。

(4)URT 和HESO1相续地为miR173加尾,使其核苷酸长度由22nt转变成23nt 或更长从而使其丧失激发tasiRNA生物合成的能力,导致tasiRNA的合成量显著下降。(5)URT1和HESO1在体外表现出不同的底物特异性。

(6)URT1和HESO1都能直接作用于AGO1结合的miRNA,加尾后的miRNA大部分仍然AGO1相结合。(7)hen 背景下URT1将miR171a由21-nt加尾成为22-nt

促使够激发phasiRNA生物合成。

(8)在体外URT1加尾修饰miR165/6,加尾后的miR165/6 RISC丧失剪切活性。