口腔微生物观察方法涂片

3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段 （2）细菌的黏附
细菌黏附和共聚是牙菌斑形成和成熟的 必要条件。
黏附是一个复杂的过程，机制尚未完全清楚。 如：钙桥作用、氢键作用、疏水作用和受体粘附素作用等等。
26
3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段
（3）牙菌斑的成熟
成熟是一个动态变化过程。 菌斑成熟的重要特征是细菌组成的变异性大。 成熟过程中细菌的组成和比例，菌斑的结构都在不 断变化，以适应环境的改变，最终发育成熟。早期 菌斑结构疏松，兼性厌氧菌为主，随后逐渐致密， 后期厌氧菌多。12小时可由菌斑染色剂显示，9天形 成各种细菌的复杂生态群体，10~30 天菌斑发育成 熟达到高峰。
冲洗，用吸水本吸干玻片上残余的水渍。 6.观察：于显微镜高倍镜及油镜下观察真菌形态。
酵母菌 1000倍
（四）多细胞真菌-曲霉（示教）
曲霉菌 400倍
曲霉菌 100倍
于显微镜高倍镜观察其菌丝和孢子形态。
（四）多细胞真菌-不染色观察
1.直接镜检：将长有真菌的平板直接放在显微镜下用 低倍镜观察菌丝和孢子。 2.涂片检查：取棉兰染液1滴于玻片上，用接种环取 少量真菌的菌丝于棉兰中混匀，盖上血盖片，尽量不 要产生气泡，低倍镜或高倍镜下观察菌丝和孢子。 3.胶带法镜检：取一小段透明胶带，粘取少量霉菌菌 落贴在玻片上，低倍镜或高倍镜下观察菌丝和孢子。
2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸
干。
（3） 用油镜观察
口腔上皮细胞和细菌 1000倍
三、牙菌斑生物膜检测 （一）目的
了解牙菌斑生物膜的概念 了解牙菌斑检测的意义
（二）牙菌斑生物膜简介
1.牙菌斑生物膜（dental plaque biofilm)
12
口腔微生物群
细菌
真菌
病毒
原虫
目前有关口腔微生物分布的研究主要是细菌，其次 是真菌，对病毒、支原体和原虫等口腔微生物分布的 文献鲜见。
13
Baidu Nhomakorabea
来源:父母或亲密接触的人
研究者们在剖腹产的新生儿口腔 中未检查出细菌，由此认为人出生 时口腔一般是无菌的。
在一项出生 1～2 天的新生儿口腔菌群调查中发现，在 新生儿口腔中检出与母亲口腔中相同血清型的唾液链球 菌 。 一项对父子（女）或母子（女）口腔内中间普雷沃 菌的检测，也发现了相同血清型的中间普雷沃菌在父子 （女）或母子（女）口腔中存在。
（四）口腔微生物观察方法
2.革兰染色
10s
①龙胆紫液
②碘液 10s
10~20s
③脱色液
冲洗，甩干
冲洗，甩干
冲洗，甩干
10s
④沙黄溶液复染
吸水纸吸干
冲洗
染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果
3.抗酸染色
(1)细菌涂片的制备（取样同革兰染色）
涂片 干燥 固定
(2)染色
1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴，在 火焰高处（2-10cm）徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂 时离开，加热3～5min，若染液蒸发减少，应再加染液， 以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。
28
牙菌斑肉眼可见吗？
牙菌斑=牙石？ 牙石是由附着于牙齿表面的菌斑和其他沉积物 如软垢等钙化而成。
29
（三）材料
（三）染色方法-酵母菌染色（石炭酸复红染色）
1.标记：取一洁净载玻片，在玻片透明区正中央画一 直径约1cm的涂片区,反扣玻片，用另一面涂片。
2.涂片：将棉签放入酵母菌稀释液中浸湿后在杯壁 上挤去多余的液体后，直接用棉签在涂片区 涂片。
3.干燥：方法同革兰染色。 4.直接镜检： 用高倍镜观察镜下形态。 5.染色：加1-2滴石碳酸复红染液覆盖标本，染色30s
无菌棉签，载玻片，染色盘，染色架，洗液瓶，酒精灯 等。
（三）口腔微生物观察方法
1.细菌涂片的制备
涂片
干燥
固定
涂片： 1）画涂片区：同革兰染色； 2）取1滴生理盐水于涂片区； 3）如图将无菌棉签放入口腔，唾液湿润棉签后擦 取内表面牙垢附近取样，之后立即与涂片区生 理盐水混合制成细菌涂片。
干燥和固定方法同革兰染色
二、口腔微生物观察 （一）目的
了解口腔微生物的种类
口腔为人体四大“菌库”之一。 口腔为机体正常微生物定植的 最佳生态区。 温度：36.5～37 ℃ 湿度：适宜 pH：5.4 ～ 7.0 营养：丰富的营养源。
口腔微生物群
口腔微生物是人类最早发现 的微生物。 细菌学之父 Antony van Leeuwenhoek ( 1632-1723 ）在 1679 年用 自制的显微镜观察到牙垢上的 各种球形、 杆状和螺旋形的 “小动物”，这就是我们现在 认识的球菌、 杆菌和螺旋体。
实验四
一. 真菌形态观察 二. 口腔微生物观察 三. 牙菌斑生物膜检测
一、真菌形态观察 （一）目的
观察单细胞和多细胞真菌形态
多细胞真菌 单细胞真菌
（二）材料
1.菌种 单细胞真菌-酵母菌 多细胞真菌-曲霉示教片（4张/班） 霉菌平板
2.染液 石碳酸复红（ 革兰染液之复染液）
3.其他 盖玻片、透明胶带、载玻片、酒精灯等
15
以上这些研究结果 均提示了细菌来源于新 生儿的母亲或密切接触 的人，以及口腔细菌在 亲属或家庭中流行 或传播的可能性。
唾液链球菌是新生儿口腔中最早定植的链球菌菌种， 98%以上的新生儿在出生后 1～2 天，即可从口腔中分 离到唾液链球菌。
（二）材料
1.菌种
自取：无菌棉签自取口腔标本获得
2.试剂 革兰染液 抗酸染液 3.其它材料
24
3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段
（1）获得性薄膜的形成
由唾液蛋白或糖蛋白选择性吸附至牙面， 形成 一层无细胞、无结构的薄膜 。
作用
促进早期菌黏附定植及细菌共聚。 为细菌提供营养物质和代谢基质。 有利于牙面的矿化或再矿化（因膜中蛋白质、氨 基酸可结合钙、磷、氟等矿物质）。 保护牙釉质：减少牙釉质对酸的敏感性。
是黏附于牙面、口内修复体和矫治器表面由微生物及 胞外多聚物（extracellular polymeric substance, EPS）等 组成的，软而未矿化，与口腔感染性疾病密切相关的，有 高度组织化和系统化的膜性聚合物。
2.特点
黏附力强，不易被水冲去或漱掉。 胞外物质基本成分：水、蛋白质、多糖、 脂质和无机物等。