发酵法生产鸟苷的工艺优化

发酵法生产鸟苷的工艺优化

摘要以菌株Bacillus Subtilis-BB518为生产菌株，对该菌株进行摇瓶发酵试验优化培养基组成。然后，利用该培养基配方进行50L全自动发酵罐发酵试验选择适当的溶解氧条件。最终，该菌种在优化的培养条件下鸟嘌呤核苷发酵水平达到17.8g/L，比出发菌株发酵产苷提高了18.7%。

关键词鸟嘌呤核苷优化溶解氧

1960年，Kuninaka[1]发现5′鸟苷酸具有较强烈的增鲜功能，在谷氨酸钠中加入1.5~2%的鸟苷酸钠可使其鲜味增加10~25倍，而鸟嘌呤核苷（简称：鸟苷）是生产鸟苷酸的原料；同时鸟苷又是抗病毒药物三氮唑核苷和无环鸟苷的前体。因此，大批量生产鸟苷前景广阔。

目前，核苷酸的工业化生产方法主要有三种：酶水解RNA法、菌体自溶法和发酵法。菌体自溶法由于产量低，提取困难而基本上不用；而两步发酵法生产鸟苷酸由于其产率高、周期短、控制易、产量大等优点，以及鸟苷可以直接透过细菌细胞膜，溶解度较低，基本上不会对嘌呤合成造成反馈抑制，通过化学或生物磷酸化形成鸟苷酸的工艺又相当成熟，因而目前已经成为工业生产鸟苷酸的主要方法。

虽然我国自80年代初已经开展了鸟苷类物质发酵的研究[2~4]，但是一直进展不大，因而鸟苷生产成本居高不下，成为限制鸟苷酸工业发展的重要环节。本课题通过摇瓶正交试验以及50L全自动发酵罐溶解氧控制试验对过程的工艺进行了优化，从而使鸟苷的发酵产率提高了18.7%，发酵产苷达到了17.8g/L。

1 材料与方法

1.1 菌种：枯草芽孢杆菌（B.Subtilis）BB518

1.2 培养基

1.2.1 斜面及茄子瓶培养基配方

葡萄糖10 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0，0.1Mpa灭菌20min。

1.2.2 种子培养基配方

葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，硫酸铵5 g/L,氯化钠5 g/L，玉米浆10 g/L，pH值7.0，0.1Mpa灭菌20min。

1.2.3 发酵培养基配方

葡萄糖120 g/L，酵母粉20 g/L，玉米浆20 g/L，硫酸铵18 g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁8g/L ，碳酸钙20g/L, pH值7.0，0.1Mpa灭菌15min。

1.3 仪器设备

FUS-50L(A)全自动发酵罐，往复式摇床。

1.4 分析方法

pH测定：Mettler Toledo在线pH检测系统，pH计。

DO 测定：Mettler Toledo 在线DO 检测系统。

鸟苷测定：纸层析法，展开剂为异丙醇：氨：水=7：2：1（v/v ）。

还原糖测定：改良斐林法。

细菌生长比浊度测定： 752分光光度计在590nm 下测定OD 值。

1.5 培养方法

1.5.1 斜面及茄子瓶种子培养：32℃培养箱中培养24小时。

1.5.2 摇瓶种子培养：250ml 摇瓶装入培养基20ml ，接一环斜面种子于32℃、110转/分往复式摇床培养11小时。

1.5.3 摇瓶发酵培养：500ml 摇瓶装入培养基18ml ，接入2ml 种子于36℃、110转/分往复式摇床培养72小时。

1.5.4 种子罐种子培养：5L 全自动发酵罐装入培养基3.5L ，接1/3茄子瓶种子于32℃、300转/分、通风比1：0.3培养10小时。

2 结果与讨论

2.1 摇瓶种子生长情况

种子生长好坏是鸟苷发酵的关键，为取得处于对数生长期的良好种子，分别用菌液比浊度净增值（△OD ）不同的种子分别接种发酵，经过连续多批次发酵验证确定：摇瓶种子的种龄为11小时。

4

6

8

101214

16

89101112131415

周期（ｈ）

产苷量（‰）ＯＤ值ＯＤ值产苷量（‰）

图1 不同△OD 对鸟苷积累的影响

2.2 摇瓶发酵培养基中各组分与鸟苷积累的关系

由于菌种Bacillus Subtilis-BB518是腺嘌呤营养缺陷型菌株，因此对酵母粉单独进行研究；随后再对培养基中其它各组分与鸟苷积累之间的关系通过正交设计进行研究来确定优化的培养基组成，使鸟苷积累量得到进一步提高。

2.2.1 发酵培养基中酵母粉含量与鸟苷积累的关系

在不改变摇瓶培养基其他配方的前提下，分别试验不同比例的酵母粉添加量对发酵产苷的影响，试验结果见图1。

图2 酵母粉对鸟苷积累量及菌体比浊度的影响

结果表明：在加入18g/L酵母粉的培养基中，鸟苷积累量最高，达到15.3g/L。低于18g/L时，菌液比浊度较低，鸟苷积累量也较少；高于18g/L时，菌液比浊度提高，但鸟苷积累量减少。分析其原因可能是，菌种Bacillus Subtilis-BB518是腺嘌呤营养缺陷型菌株，因此必需供给一定量的腺嘌呤菌体才能生长，而酵母粉中含有一定量的腺嘌呤。当酵母粉含量较低时，菌液比浊度也较低，菌体数量达不到鸟苷生产的要求；酵母粉含量较高时，菌液比浊度也较高，菌体数量过多，培养基中的营养都用于生长菌体，鸟苷积累量减少；只有菌体比浊度适中时才能维持生长与代谢的平衡。这一点可以通过糖的消耗速率来验证。

2.2.2 发酵培养基中其它组分含量与鸟苷积累的关系

根据文献报导有关影响鸟苷积累的因素[4,5],结合本菌株自身培养条件,按照

正交表L

9(3

4

)制定4因素优化方案: A=玉米浆(1.5,2.0,2.5),B=硫酸铵

(1.5,2.0,2.5),C=磷酸二氢钾(0.2,0.6,1.0)，D=硫酸镁(0.4,0.8,1.2),发酵结束补水以回复体积,测定发酵样中鸟苷含量,试验设计及试验结果见表1和表2。