细菌耐药机制(huishi)

VIM型金属酶分布
• • • • • • VIM-5 2004 土耳其 肺克 铜绿 VIM-6 2004 新加坡 恶臭假单胞 VIM-7 2004 美国 铜绿 VIM-8 哥伦比亚 铜绿 VIM-9，10 英国 VIM-11 阿根廷 意大利
亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检测结果
上海 北京 （27） （32）
是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨 基β-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被 克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺 酶。 ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类 中属于2be类酶。
ESBLs的分类
根据基因同源性不同分为：
– TEM型 80
– SHV型
• 天然来源碳青霉烯酶
– 嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶
• 获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）
– B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1 – A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等 – D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54
金属酶
• 染色体编码的金属酶：BC Ⅱ，L1,TUS-1,MUS1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。 • 获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于 可转移的基因元件上，造成区域性传播。
Map of China
ACT-1,DHA-1,CMY (Peking)
DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai) DHA-1 (Zhejiang) DHA-1,ACT-1 (GuangZhou)
DHA-1 is The Predominant Type in China
IS26
ORF1
亚胺培南敏感及耐药 的产气肠杆菌SDS图
C1 C2:亚胺培南敏感
C3 C4:亚胺培南耐药
PCR扩增Omp36全长及序列分析
IS903 98%
（约1000bp)
插入序列引起OprD2缺wk.baidu.com（铜绿）
OprD2 ISPa1328
约2000bp
二、 产生灭活酶
细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解
或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位
新疆 29 3 5 8
郑州 37 5 2 2 2
合 计 209 57 29 8 3
EC KP EC KP EC KP EC KP
中国 400株 大肠 埃希 菌和 肺炎 克雷 伯菌 的基 因型 分布
CTX-M-3 CTX-M-24 CTX-M-22 CTX-M-9 CTX-M-28 CTX-M-13 CTX-M-27 CTX-M-29 SHV-12 SHV-5 SHV-2 CTX-M-14+CTX-M-22 CTX-M-14+CTX-M-3 CTX-M-14+SHV-12 CTX-M-3+SHV-12 CTX-M-9+SHV-12 CTX-M-22+SHV-12 CTX-M-24+SHV-12 CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-12 CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-12 未检出 ESBLs 基因型 合计
细菌耐药机制研究进展
浙江大学医学院附属第一医院 俞云松
Antibiotic interactions with gram negative organisms
Cephalosporins
slower diffusion due to bulk and ionic charges
Imipenem
Rapid diffusion due to small size and zwitterionic +/- charge)
之前失去活性
细菌产生的灭活酶主要有：

β-内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶
-内酰胺酶
最主要的耐药因素
对-内酰胺抗生素造成威胁
临床上最重要的-内酰胺酶
超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 高产AmpC酶
碳青霉烯酶
超广谱-内酰胺酶 （extended-spectrum -lactamases，ESBLs）
A
intI1
attI1
aacA4
59-b VIM-2
59-be
aadB
59-be
3’-CS
B
A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 结构同In72 B： S5， S9， S10， S11， S12 （S15、H22除外）
PFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海的六株为同一类型，来自北京 的三株分两个类型，来自杭州的四株同样也分两个类型。各地区之间的类型 各不相同。 反复尝试通过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。 经XbaI内切酶消化的染色体PFGE与VIM-2探针杂交显示其中10株铜绿假单胞 菌50-kb大小的酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22、H26、B2）没有阳性片 段。
OmpF OmpC
Beta Lactamases
(hydrolyzing enzymes)
penicillin binding proteins
PBP3 PB1b
CBD/RR
PBP2
PBP1a
一、外膜孔蛋白减少或丢失
• 细胞内抗生素浓度降低 – 膜孔蛋白(OprD):
膜孔蛋白
细胞外膜上的 某些特殊蛋白是
(GenBank accession number : AY780889 ) 903bp 921bp 882bp 876bp 921bp
IS2
IS903
Imi-2R
IMI-2
IS903
10629bp Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性 99%，仅在37位由天冬氨酸→天冬酰胺，106位由组 氨酸→酪氨酸
如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌
所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小 分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。
“后天获得”
一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过 降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通 道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细
菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。
亚胺培南是一种非典型的β-内酰胺类抗菌药物，主要是通 过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦 这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。
产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株
亚胺培南敏感及耐药的 产气肠杆菌PFGE图
C1 C2:亚胺培南敏感
C3 C4:亚胺培南耐药
VIM型金属酶
• VIM 型金属酶 与 IMP 类金属酶同源性 40 ％，但两类金属酶的 动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。 目前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间的 序列可将VIM金属酶大致分为三组： 1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b 3）VIM-7
1
1
3 1 1 1
1 1 1 3 1 1 2 2 4 2 1 1 1 1 1 1 1 7 55 8 43 1 109 4 61 6 42 8 26 9 58 1 6 3 1 3 4 4 1 5 1
10 4 2 16 2 4 1 1 1 1 1 1 44 400
32家医院 1994-2003年 大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率
一种非特异性的、
跨越细胞膜的水 溶性物质扩散通 道。
革兰阴性细菌细胞膜
“先天不足”
某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使 一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药” 或“固有性耐药”（intrinsically resistant），即这种耐 药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所 致。
H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker
H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker
50kb
A
B
碳青霉烯类抗生素水解酶 Ａ类酶
包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导 的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎 克雷伯菌中质粒介导的KPC-1-4酶、铜绿假单胞 菌中质粒介导的GES-2酶。
12
≥256 128 ≥256 ≥256 ≥256
0.05
0.5 0.25 2 12 8
0.125
1.5 2 4 32 64
0.094
0.047 6 2 4 1.5
0.047
4 2 4 32 ND
阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱
M1A B M2
54kb
15kb
Schematic representation of the cloned E.coRⅠfragment
E cloacae
≥32 0.064 4 2 16
E C600
0.38 0.25 2 0.064 0.5
E.coli C600E8
≥32 0.25 2 0.064 0.38
E.coli DH5
0.25 0.006 0.25 0.125 0.5
E.coli pT103
≥32 008 0.38 0.047 0.25
二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果
E cloacae 8, E C600, E.coli C600E8，E.coli pT103
和E.coli DH5对抗菌药物的体外抗菌活性
MIC(mg/l) Antibiotics
Imipenem Ciprofloxacin Amikacin Cefepime Ceftazidime Cefotaxime Cefoperazone Cefoperazone/ Sulbactam Piperacillin/ Tazobactam Ticarcilliin/ ClavulanicAcid Ampicillin/ Sulbactam
VIM型金属酶分布
• VIM-1 1999年 意大利 铜绿 氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单 胞 2003－2004希腊 大肠 肺克 法国 肺克
• VIM-2 2000 法国 铜绿 意大利 希腊 日本 韩国 葡萄 牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国 中国 • VIM-3 2001年 台湾地区 铜绿 • VIM-4 2002年 希腊 铜绿 2003 瑞典 铜绿 2004 意大 利 肺克 阴沟 2004 波兰 铜绿
70 60 50
百分比
40 30 20 10 0
1994
1995
1996
1998
1999 年份
2000 肺炎克雷伯菌
2001
2002
2003
2004
大肠杆菌
头孢菌素酶
大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌 种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、 普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产
生染色体介导的AmpC酶。
阴沟肠杆菌
金属酶表 型阳性菌 株数 百分率 金属酶基 因型阳性 菌株数 百分率
杭州 广州 成都 （27） （32） （22）
3 1 0 0.0％ 0 0.0％
3
5
11.1％ 15.6％ 3 6
11.1％ 3.1％ 4 1
11.1％ 18.8％
14.8％ 3.1％
VIM-2基因整合子结构图
intI1 attI1 aacA4 59-be VIM-2 59-be 3’-CS
orf-1
ORF2
DHA-1
ORF3
ampR
ORF4
qacE⊿1
ORF5
sul1
ORF6
共6432bp
PCR产物1100bp 5232 bp
克隆片段
碳青霉烯酶
指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青 霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶 分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类 酶。
碳青霉烯酶按其来源可分为
抗菌药物 亚胺培南
肺炎克雷伯菌
>32
46
– CTX-M型 37 – OXA型 – 其它型 18 20
CTX-M-1组 CTX-M-2组 CTX-M-8组 CTX-M-9组
http://www.lahey.org/studies/webt.htm.
基因型 CTX-M-14
北京 23 16 5 7 16 5
浙江 76 6 9 2 3 1 3 1 8 6
IMP型金属酶
• IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之 间的序列表明：IMP型金属酶大致可以分为两组： 1）IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20
中国
• IMP-4 2001年香港 鲍曼 2001年广州 杨格枸橼酸杆菌 、铜绿 • IMP-1 2004年12月 江苏无锡 铜绿 • IMP-8 2001 台湾 铜绿