细菌耐药 PPT课件

• （5）等电聚焦及克拉维酸抑制试验：将临床分离
菌中粗提的未知ESBLs进行等电聚焦电泳，,测定 其等电点(PI),与已知酶的ESBLs的PI进行比较,又 根据克拉维酸可以抑制的ESBLs活性，而对其他β内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。可先用
克拉维酸对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝 噻吩进行显色反应，可进行ESBLs的检测和分型。
二、细菌耐药的化学机制 （一）产生灭活抗生素的各种酶 (二 ) 膜通透性下降 （三）抗菌药物作用靶位改变 （四）细菌主动药物外排机制 （五）细菌生物被膜的形成
• 几种常见的可灭活抗生素的酶
1、β-内酰胺酶(β-lactamase)
（1）超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs) （2）头孢菌素酶（AmpC酶） （3）碳青霉烯酶 （4）金属酶
（3）双纸片协同法：根据ESBLs可水解三代头孢，有可被克 拉维酸抑制的原理，将阿莫西林/克拉维酸抑制纸片置于 头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南中间，使两纸片 中心间距为20～30mm，如果在阿莫西林/克拉维酸与任何 一种纸片间出现协同抑菌现象,视为产ESBLs株。此法操作 简便，特异性、灵敏度菌较好，可作为检测大肠埃希菌、 肺炎克雷伯菌产ESBLs的常规方法。
细菌耐药机制及检测
一、细菌耐药的遗传机制
细菌耐药性的遗传学机制主要指细菌的 耐药性通过基因突变(即染色体介导的耐药 性)获得，或通过质粒或转座子水平传播获 得外源耐药性基因，也可通过整合子捕获 外源基因使之转变为功能性基因来传播耐 药性。
• 1、染色体介导的耐药 • 2、质粒介导的耐药 • 3、整合子介导的耐药
• （6）产酶基因的检测：提取待测菌的DNA作为扩
增模板,采用已知标准酶基因的特异性引物,进行体 外循来自百度文库扩增,结果如为阳性说明有已知ESBLs的产 酶基因。还可对扩增产物进行测序，确定ESBLs的 类型。
（六）Ⅰ型β-內酰胺酶（AmpC酶）
（1）头孢西丁敏感实验：根据AmpC酶可以水解头孢西丁 （FOX），而ESBLs等其他β-内酰胺酶一般不能分解头孢 西丁这一特性，可以对AmpC酶的菌株进行初步筛选。具 体操作方法：（1）纸片扩散法：按美国临床实验室标准 委员会（NCCLS）的纸片扩散（K-B）法进行。FOX纸片的 含量为30ug。判断标准为抑菌环<18mm,表示待检菌株对 FOX耐药。（2）稀释法：参照NCCLS的方法进行，判断 标准为MIC＞16ug/ml，表示待检菌株对FOX耐药。对FOX 耐药的菌株，应怀疑产AmpC酶的可能。此方法仅作为初 步筛选。需做三维试验或纸片协同试验等进一步的确定。
革兰阴性菌：产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌 和大肠埃希菌(ESBLs)；持续高产Ι型β-内酰胺酶 的阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等；多重耐药的铜绿 假单胞菌、不动杆菌、嗜麦芽窄假单胞菌。
对异烟肼和利福平耐药的多重耐药结核分枝杆菌 （Multidrug resistance Mycobacteria tuberculosis,MDR-Tb）。
（2）AmpC酶表型筛选试验：根据AmpC酶对大部分头孢菌 素、尤其是三代头孢菌素耐药的特性，对产AmpC酶的菌 株进行表型筛选。选用亚胺培南（IP）、头孢吡肟 （FEP）、头孢他啶/克拉维酸（CAZ/Cla）、头孢噻肟 （CTX）和头孢噻肟/克拉维酸（CTX/Cla）5种抗菌药物纸 片，按NCCLS的K-B法进行操作。判断方法：（1）IP、 FEP敏感，而CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla耐药；（2）IP、 FEP敏感，而在CTX、CAZ/Cla和CTX/Cla的抑菌环内存在 散在的菌落；（3）IP敏感，而FEP、CAZ/Cla和CTX/Cla耐 药。以上三种结果提示，待检菌株产AmpC酶。最后一种 表型提示，待检菌株产AmpC酶的同时，产生其他β-内酰 胺酶，如产ESBLs。此方法操作简便、快速省时，较三维 实验简单得多，可作为产AmpC酶菌株的筛选试验。
具体操作方法：用超声粉碎法制备待检细菌中的β-内酰胺酶 粗提物，再对待测β-内酰胺酶进行等电聚焦（用两份同种 β-内酰胺酶粗提物跑出两块凝胶板，电泳的条件完全相 同）。在一块凝胶板（A）上覆盖浸有氟氯西林 （1mmol/L）的滤纸条，另一块凝胶板（B）上仅覆盖用 无菌蒸馏水浸润的滤纸条，30s后去除两块凝胶板上的滤 纸，再分别覆盖上浸润头孢硝噻吩（500ug/ml）的滤纸条， 1min后揭去滤纸条，观察结果。如果A、B两块凝胶板上 的条带颜色不同，即在B板上变色（有黄变红者）、而在A 板上不变色（仍为黄色）的条带，即为AmpC酶阳性。与 三维试验相同，该方法也是利用酶的粗提物而不是活菌做 检测，不受抗菌药物的诱导影响，还可确定AmpC酶的型 别。但缺点较三维试验更繁琐、费时，不宜在临床微生物 实验室推广应用。
（1）纸片筛选法：含4%NaCl的MH琼脂，30μg/片 头孢西丁，33-35℃，24小时。对于金黄色葡萄球 菌，抑菌环直径≤19mm，为MRSA，抑菌环直径 ≥20mm，为MSSA；对于凝固酶阴性葡萄球菌， 抑菌环直径≤24mm，为MRCONS，抑菌环直径 ≥25mm，为MSCONS。
（2）琼脂筛选法：MH琼脂中加入6ug/ml苯唑西林、 4%氯化钠，直接菌落悬液法，涂布接种，≤35℃， 孵育至24小时。任何有生长的现象均为MRS。
四、主要的耐药性检测方法
（一）耐青霉素G的肺炎链球菌（PRSP）
筛选试验：1μg/片苯唑青霉素，MH琼脂+5%羊血，35℃含 5%CO2%环境中孵育20-24小时，抑菌环直径≤19mm耐 药，≥20mm敏感；确证试验：稀释法测定青霉素MIC， MIC≤0.06μg/ml敏感 ≥2μg/ml耐药。
（二）耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）
2、氨基糖苷类抗菌药物钝化酶 3、MSL类钝化酶
4、氯霉素钝化酶
三、当前主要的耐药性问题
革兰阳性菌：耐青霉素肺炎链球菌（Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP）；耐 甲氧西林葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococci,MRS）；耐万古霉素肠球菌 （Vancomycin resistant enterococcus,VRE）及耐 万古霉素金黄色葡萄球菌（Vancomycin resistant S.aureus,VRSA）。
（3）乳胶凝集或基因扩增法直接检测MecA基因。
（三）万古霉素中介或耐药的葡萄球菌，VIS 或VRS
筛选方法：MH琼脂，万古霉素（30μg/片），抑 菌环直径≤14mm应测MIC；肉汤稀释法MIC8～
16μg/ml为VIS，MIC≥32μg/ml为VRS。任何耐 万古霉素的葡萄球菌均应送参考实验室进 一步检测。
（4）头孢曲松三维试验：根据ESBLs可水解三代头孢，但不 被氯唑西林抑制的特点，按标准纸片扩散法操作，取相当 于0.5麦氏浊度的标准大肠埃希菌ATCC25922菌液，接种 M-H琼脂平板，平板中心贴一30ug头孢曲松纸片，再距头 孢曲松纸片5mm处分两个方向划两条长约15mm的狭缝， 其中一条加40ul酶提取液，另一条加36ul酶提取液和 4ul2*10000umol氯唑西林，35℃过夜，若单加酶提取液 的狭缝和加酶提取液和氟氯西林的狭缝与抑菌圈交接处均 出现扩大生长区域，视为ESBLs三维试验阳性。此法利用 酶的粗提物检测，又用氯唑西林抑制，消除了其他酶存在 对检测结果的影响，尤其适用于大肠埃希菌和克雷伯菌以 外的革兰阴性杆菌ESBLs的检测。
（四）耐万古霉素的肠球菌
检测方法：30μg/片万古霉素，抑菌环≤14mm为 耐万古霉素肠球菌。
（五）超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases ESBLs）
（1）药敏推测法：根据ESBLs能水解三代头孢的原理进行检 测。用标准琼脂扩散法测定头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、 头孢泊肟和头孢曲松的抑菌环直径，按NCCLS标准进行判 断。凡头孢他啶抑菌环直径≤22mm、头孢泊肟抑菌环直 径≤17mm、氨曲南或头孢噻肟抑菌环直径≤27mm、头孢 曲松抑菌环直径≤25mm，任何一种药物抑菌环直径达到 上述标准，或用稀释法检测上述药物的MIC大于等于 2ug/ml,均疑为ESBLs菌株。应进一步作确证试验确诊。
（5）等电聚焦及氟氯西林抑制试验：一般的AmpC酶的等电 点（PI）偏碱，且大多大于等于9.0，故可用物理方法先 将其从待检菌细胞中释放出来，制成酶粗提物，再用等电 聚焦的方法在琼脂糖凝胶板上将其与其他 β-内酰胺酶或其 他蛋白成份分开。又根据氟氯西林可以抑制AmpC酶的活 性，而对其他β-内酰胺酶的活性无明显抑制作用的特性。 若先用氟氯西林对凝胶板上的酶进行抑制，再用头孢硝噻 吩进行显色反应，被抑制掉的条带即可能为AmpC酶条带。
• （3）氯唑西林（CLO）双抑制剂扩散协同实验：根据氟
氯西林（CLO）可抑制AmpC酶的特性进行检测，按 NCCLS的K-B法操作，在M-H平板上均匀涂布待检菌株， 中央贴一空白纸片，并在其周围20～25mm处贴上头孢他 啶（CAZ）、头孢曲松（CRO）、头孢哌酮（CFP）、氨 曲南（ATM）和头孢噻肟（CTX）纸片，再在空白纸片上 滴加10mg/mlCLO20ul,35。C孵育18～24h,观察纸片之间 的抑菌环情况，CLO与任何一种头孢菌素协同为阳性，提 示产AmpC酶。因CLO在琼脂中的扩散能力较差，故将FCC
药液直接加在空白纸片上进行扩散，效果较好。此方法操
作简便、快速省时。结果基本可靠，可以在各临床微生物
实验室推广应用。
• （4）酶提取液三维试验：利用AmpC酶可以水解头孢西丁
的原理操作。①制备β-内酰胺酶粗提物：将待检菌株接种 在M-H肉汤或胰蛋白大豆胨水增菌，离心收集细菌，用 0.01mol/l的磷酸盐缓冲液或PBS（PH7.0）冲洗后制成一 定浓度的细菌悬液，再用冻融法（-70℃快速冷冻、室温 或37℃水浴快速解冻，反复5次）或超声粉碎法（4℃超声 粉碎）破碎菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，再离心 （12.000r/min,1h）去除细菌碎片，收集上清液即为β-内 酰胺酶粗提物。②三维试验：将大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922按NCCLS的K-B法涂布在M-H平板上，在平板 的中央贴一张FOX纸片，从距离纸片5mm处用无菌刀片在 平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平 板可切4～5条裂隙），每一裂隙中加入25～30ul的一种待 检菌株的β-内酰胺酶粗提物35℃培养18～24 h，观察结果。 裂隙的内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌 环有缺失者为AmpC酶阳性。因利用酶的粗提物而不是活 菌做检测，不受抗菌药物的诱导的影响，故三维试验是目 前公认的、较为经典的 检测（去阻遏）持续高产AmpC酶 的方法，也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法。但缺点 是需增菌、破碎菌细胞并提取酶的粗提物，操作繁琐、费 时，难以在临床微生物实验室常规应用。
（2）表型确证试验：根据ESBLs可被克拉维酸抑制的原理， 按NCCLS推荐的指南进行操作，包括纸片法和稀释法。前 者采用头孢他啶(30μg)及头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg) 组合，头孢噻肟(30μg)及头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg) 组合，任一组药物的抑菌环的直径差≥5 mm时，判定为 ESBLs阳性株。
• （6）AmpC酶的基因检测：AmpC酶的基因组是由一种结
构基因—ampC和四种调控基因— ampR,ampD,ampE,ampG组成，AmpC酶基因存在于阴沟 肠杆菌、福氏志贺菌、普通变形杆菌及肺炎克雷伯菌等产 AmpC酶的细菌的染色体远端或质粒中。存在于不同细菌 中的AmpC酶基因其特定的核苷酸序列都是相同的，即不 论是结构基因ampC还是各种调控基因，都有其特定的核 苷酸序列。故通过查找待检细菌中有无特定的AmpC酶的 基因片段（通过特异性的基因引物，扩增待检细菌中特定 的AmpC酶的基因片段，分析其特定的核苷酸序列），即 可确定待检细菌能否产AmpC酶。如将PCR产物测序，并 与标准序列相比较，还可检测AmpC酶的型别。AmpC酶的 基因检测法可直接检测待检细菌中染色体或质粒上的 ampC基因或ampD基因片段，不受表型和外界因素的影响， 准确性高。但该方法的实验操作仍较繁琐，不适合于临床 常规应用。