(完整版)纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定
1.纤维素酶活力单位定义
在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.
2.测定原理
纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.
3.试剂与溶液
除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.
3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:
称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.
3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:
吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.
3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:
称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.
3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:
称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.
3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:
称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.
3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)
称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.
3.7 DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.
4 仪器与设备
4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.
4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).
4.3 分析天平:感量0.001g.
4.4 pH计:精确至0.01.
4.5 磁力搅拌器:附加热功能.
4.6 电磁振荡器.
4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.
4.8 离心机:2000g以上.
4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.
4.10 秒表:每小时误差不超过5s.
4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.
4.12 移掖器;精度为1l.
5 标准曲线的绘制
吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.
分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.
以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.
6 试样溶液的制备
固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).
称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).
液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.
7 测定步骤
吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.
吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.
8.试样酶活力的计算
[(AE - AB)×K + CO]
XD = × 1000 (1)
M×t
式(1)中:
XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;
AE —酶反应液的吸光度;
AB —酶空白样的吸光度;
K —标准曲线的斜率;
CO —标准曲线的截距;
M —葡萄糖的分子量(180.2);
t —酶解反应时间,min;
1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.
XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.
X = XD•Df (2)
式(2)中:
X —试样纤维素酶的活力,u/g;
Df —试样的总稀释倍数.
酶活力的计算值保留三位有效数字.
9 重复性
同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)
1.药品、试剂及仪器
脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。

2.脂肪酸吸光度工作曲线的绘制
配制一系列不同浓度（1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，10，12.5，15μmol/mL）的油酸正己烷溶液，分别取5mL于10mL离心管中中，加入1mL显色剂，磁力搅拌3min，油酸分子与Cu2+生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在714nm处测定吸光度。

用未加油酸的空白溶液作参比，以吸光度对油酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线。

3.酶液的配置
分别称取固定化酶0.1g左右溶于2mL，pH=7.4，0.0667mol/L的磷酸缓冲溶液中，振荡均匀，40℃水浴预热待用。

4.酶活测定方法
实验组：取3mL.0.0667mol/L磷酸盐缓冲溶液和1mL橄榄油，放入超声仪恒温50℃
超声10min，加入2mL（含0.1g酶制剂）酶溶液（先超声混匀10min），磁力搅拌15min，立即加入1mL6mol/L盐酸溶液和6mL的95%无水乙醇溶液，振荡2min，终止反应。

分别加入6mL正己烷溶液萃取生成的脂肪酸。

取上层有机相5mL于10mL离心管中，加入1mL显色剂，
涡旋均匀后，产生的脂肪酸与Cu2+
生成绿色络合物。

静置离心10min后,取上层含有脂肪酸铜的正己烷溶液，在714nm波长处测其吸光度。

空白组：以相同方法制备不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度工作曲
线，即可求得脂肪酸的浓度。

5.酶活定义及计算公式
脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

按下式计算酶活：
X=cV/tm
式中：X为脂肪酶活力，U/g，c为脂肪酸浓度，μmol/mL；V为脂肪酸溶液的体积，mL；m 为酶液的用量，g；t为作用时间，min。

换成其他的酶的话，基本的一样，只是底物不一样而已！！！。