真核生物三种RNA聚合酶的特点

1．简述真核生物三种RNA聚合酶的特点？

下边是详细的

RNA聚合酶Ⅰ的转录产物是45SrRNA，经剪接修饰后生成除5SrRNA 外的各种rRNA。rRNA与蛋白质组成的核糖体是蛋白质合成的场所。RNA聚合酶Ⅱ在核内转录生成hnRNA，经剪接加工后生成的mRNA被运送到胞质中作为蛋白质合成的模板。

RNA聚合酶Ⅲ的转录产物是tRNA，5SrRNA,snRNA，其中snRNA参与RNA的剪接。

2．简述乳糖操纵子的调控原理？

答：答：（1）乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I. （2）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。（3）CAP的正调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡糖糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。

（4）协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

3．简述DNA聚合酶和DNA连接酶在DNA复制中的作用？

答：DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。 DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。

原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II 则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH

生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA 上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

4．简述真核生物基因时空表达的意义？

答：所有生物的基因表达都具有严格的规律性，即表现为时间特异性和空间特异性。

基因表达的时间特异性是指某一特定基因的表达按一定的时间顺序发生。如编码甲胎蛋白的基因在胎儿肝细胞中活跃表达，因此合成大量的甲胎蛋白。在成年后该基因的表达水平很低，几乎检测不到ATP。但是，当肝细胞发生转化形成肝癌细胞时，编码ATP的基因又重新被激活，大量的AFP被合成。

空间特异性是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因在不同的组织器官表达不同。在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达水平是不一样的。在个体生长、发育过程中，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性。

5．已知一个编码蛋白质的cDNA序列，如何才能得到相应的蛋白质？

1、从基因文库或cDNA文库中分离目的基因或通过pcr扩增得到目的基因；

2、体外构建重组DNA分子，选择合适的克隆载体如PBV220，用限制型内切酶分别加工外源基因与载体DNA，再用T4DNA连接酶连接外源基因与载体DNA，构建出重组质粒DNA分子；

3、重组质粒DNA导入宿主细胞：制备感受态大肠杆菌宿主细胞DH5α，将重组题分子导入宿主细胞，涂布在含有Amp的LB固体平板上，37℃培养；

4、挑选单菌落，提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，如果酶切产物的大小为2.7kb左右，则通过测序确认序列的正确性；

5、表达：将所得阳性克隆在30℃培养适当时间，使得菌密度较高以后，升温42℃诱导基因的表达，2~3小时以后，离心收集菌体，用SDS-PAGE检测目的基因的表达；

6、纯化：破细胞后用适当的方法纯化出目的蛋白。

6．结合你的课题，举例说明你的硕士阶段可能会用到的3种分子生物学技术（如果研究领域不涉及分子生物学技术，可简单谈谈自己研究领域的前景）

答：（1）Western Blot，所谓免疫印迹是一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。就是把正常的细胞打碎，分离出

各种蛋白质抗原，经特殊的电泳(SDS-PAGE)方法分离并转移到一张硝酸纤维薄膜(NC)或PVDF膜上固定。由于各种抗原分子量大小不同，所以在电场中泳动的速度不同，在硝酸纤维薄膜上所占据的位置也不同，各种抗原有它相应固定的位置。然后把标记的特异性抗体与薄膜上的抗原结合，通过标记的抗原抗体反应就能显示出可见的结果。

（2）ELISA的基础是抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍然保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，加入没反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据成色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

（3）PCR：PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP 和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

RNAi与miRNA介导的调控

非编码RNA：rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，RNAi，siRNA，miRNA

核仁小分子RNA（snoRNA）是一类广泛分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA，具有保守的结构元件.分为3大类：boxC／D snoRNA 、boxH／ACA snoRNA 、MRP RNA。研究发现，snoRNA除了在核糖体RNA的生物合成中发挥作用之外，还能够指导snRNA、tRNA 和mRNA的转录后修饰。此外，还有相当数量的snoRNA功能不明，被称为sn0RNA（orphansnoRNA）。在哺乳动物的snoRNA中，印迹snoRNA（imprintedsnoRNA）是最为特殊的一群，由基因组印迹区编码，具有明显的组织表达特异性。原核生物古细菌中类snoRNA 的鉴定表明这些非编码RNA家族成员的古老起源；而哺乳动物中大量的snoRNA反转座子的存在更为人们探索snoRNA在基因组中扩增和功能进化提供了新的思路。

小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端粒酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。RNA干涉（RNAi）：①RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与

内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA （mRNA）进行降解的指导要素。

小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA （mRNA）进行降解的指导要素。

miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

RNAi（RNA干涉）技术及其应用

RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA 从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA （ssRNA, single- stranded RNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效定位目标mRNA。siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。

由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。PCR 及分子标记

三步：变性，低温退火，延伸。

PCR循环：95度去变性双链DNA，55度去使引物结合，72度聚合延伸。

Mg2+,dNTPs，模板引物，缓冲液，酶，是必须得。

历史

60s-70s：基因的体外分离技术。

Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。