发育生物学第二章生殖干细胞

• 野生型gcl基因在成蝇卵巢中的滋养细胞内转录，其 mRNA被输送进卵子的最后部，成为极质的一部分,并于 卵裂早期翻译成蛋白质。相反，纯合突变♀蝇(gcl-gcl-)所 产的卵子和胚胎中则检测不到该基因的产物。 • 跟踪观察表明，gcl编码的蛋白质进入了细胞核内，它对 于极细胞的产生至为关键。当把gcl信使的反义RNA导入 胚内时，同样会失去产生生殖细胞的能力。
• 果蝇极质的成份之一是无生殖细胞基因 (germ cell-less, gcl) 的mRNA。gcl由Jongens等(1992)发现，当时他们诱变果 蝇并筛选到没有孙子的♀性突变体。他们假设，如果一个 ♀蝇未能将有功能的极质储存于所产的卵子内，受精后这 些卵子仍能发育成为后代，但这些后代因其胚胎内缺乏生 殖细胞而导致不育。
• 由此可见，极粒由两大部分组成，一是生殖细 胞决定子，二是维持这些决定子正确定位与稳 定的骨架结构。该骨架与gcl mRNA以及其它可 能作为生殖细胞决定子的基因产物相结合。
• 这些信使于卵裂早期翻译成蛋白质，然后进入 极细胞的核内，通过激活所控制的下游基因来 启动生殖细胞的发育程序。
2.1.1.5脊椎动物生殖细胞的决定
• 若将OSKAR注射到卵子前端下方，可诱导极 细胞在胚前端异位发生(Ectopic) ，但前端产 生的极细胞不能进入生殖腺。 • 由此可见，合胞期的胚核是全能的，能分化成 任何类型的细胞。达到后极的无论是哪些核， 都是最早形成的细胞，并与极质相结合变成配 子的前体。
• 自然界亦提供了极质和P颗粒的重要证据。果 蝇有一种无孙子突变体,其纯合♀蝇(gg)能产生 形体正常但不育的后代，即gg♀×GG♂所产 生的全部杂合体子代Gg都是不能生育的。 • Mahowald 及其同事(1979)证明，上述杂交后 代胚胎的细胞核不向极质内迁移，没有极细 胞形成，故成体也没有产生配子的原始生殖 细胞。
• OSKAR是极粒骨架的主要组分，VASA和 TUDOR再附着到OSKAR上形成更复杂的空间结 构并与生殖细胞决定子相结合(Breitwieser et al. 1996)。 • gcl mRNA和mtlrRNA在卵后部的定位能够被前述 ６种基因及oskar中的任何一种突变所消除。 • 在valois和tudor突变体中，开始能发现少量gcl mRNA定位于早期胚胎的后端，但在卵裂后期便 消失了。
第二章 配子发生与发育前的准备
2.1 配子发生 2.1.1原始生殖细胞的起源与决定 2.1.1.1不对称分裂与生殖细胞的起源 2.1.1.2染色体消减 2.1.1.3极质、极粒与生殖细胞决定 2.1.1.4极粒的主要成分与母体效应基因 2.1.1.5脊椎动物生殖细胞的决定 2.1.2雌雄配子的发生过程 2.2 发育前的准备 2.2.1核仁扩增与rRNAs储备 2.2.2灯刷染色体与RNA转录 2.2.3滋养细胞与母体效应基因的活动 2.3 亲缘印迹(parental imprinting)
不对称细胞分裂能使所产生的两个子细胞出 现发育途径的分歧； 部分卵裂球内发生染色体消减而另一部分则 保持完整会直接导致体细胞与种系细胞之间 的分化； 某些母体效应基因的转录、表达产物在卵子 内局部差异分布对原始生殖细胞的形成具决 定作用。
2.1.1.1不对称细胞分裂与生殖细胞的起源
在某些动物的受精卵中，母体效应基因的产物如 RNA和蛋白质所组成的RNP颗粒等发育决定因子呈 不均匀的区域分布。当卵裂时，这些决定因子被不 均等地分配到子细胞中，导致两个细胞具有不同的 发育潜能并朝着不同方向演变。这种细胞分裂方式 称为不对称细胞分裂。
• NANOS是果蝇腹节形成所必需的，同时也是生殖细胞 形成所必需的。没有NANOS的极细胞不能迁移进生殖 腺，因而不能变成配子。
• 第三个候选者是线粒体的核糖体RNA (Mitochondrial ribosomal RNA，mtrRNA)。应用 辐射检测系统，Kobayashi和Okada(1989)证明，向 被UV照射过的胚胎导入mtrRNA可以恢复该胚胎形 成极细胞的能力。
• 极粒的装配由oskar 信使组织，该mRNA的数量和 位置决定极细胞的数量和位置。来自仅有1份 oskar拷贝的果蝇胚胎在细胞囊胚期产生10-15个 极细胞，而双份拷贝的果蝇胚胎则可产生约35个 极细胞，4拷贝就会形成约50个极细胞。
• Ephrussi和Lehmann(1992)还证明，生殖细胞将 在oskar mRNA定位的任何地方形成。如果将 oskar mRNA移至胚胎的前端，极质及原始生殖细 胞将在前端形成。
2.1.1.2染色体消减
马蛔虫(Parascaris equorum) 2n=4，是染色体数最 少的一种多细胞动物。虽同为线虫，但马蛔虫原 始生殖细胞的发生走的是另一条不同的途径。
1904年， T.Boveri发现马蛔虫第二次卵裂前中期， 动物极分裂球的染色体碎裂成断片且大多丢失， 原来的染色体仅一部分保留下来。这种现象称染 色体消减(Chromosome diminution)。这些细胞因 此丢失了许多基因(Tobler et al., 1972)。与此同时， 植物极分裂球的染色体却保持完整。
然而，下一次卵裂仍沿着动植物极轴的赤道 板进行，结果两个动物极分裂球仍会经历消 减，而两个植物极分裂球则不发生染色体消 减。 因此，他得出结论认为，受精卵内局部胞质 分布不均，植物极区一定存在阻止染色体消 减的细胞质因子和决定植物极细胞成为种系 (Germ line)细胞的决定因子。
2.1.1.3极质、极粒与生殖细胞决定
• 关于极质的研究，近期主要集中于果蝇。果 蝇的原始生殖细胞称为极细胞(Pole cell)，由 数个细胞核迁移至卵后端极质内然后细胞化 而成，是胚胎中最早分化形成的细胞。这些 极细胞形成时，将极质内的极粒包裹于内。
• 极粒含蛋白质和RNA，包括生殖细胞决定因 子。这些决定因子是母体效应基因的产物， 如oskar基因的表达产物OSKAR蛋白等。
在卵裂早期，每一次不对称分裂产生一个 建立者细胞(Founder cell)和一个干细胞 (stem cell)。前者将朝被决定的方向产生分 化的细胞后代(体细胞或生殖细胞)，后者则 继续通过不对称分裂形成新的建立者细胞 和干细胞。 这些建立者细胞是由卵子内的发育决定因 子预先决定的，其子细胞将按既定的发育 程序进行自主发育，不受环境变化的影响。
• 是什么指引gcl mRNA、 nanos mRNA和mtrRNA 等成分定位到卵子的后端呢？至少还发现另外有 6个基因发挥了作用，它们的突变体不能形成生 殖细胞，而且也很少形成腹节。
• 这些突变基因是cappucino, spire, staufen, vasa, valois和tuder。所有这些基因活跃于卵巢并将其 产物输送到生长着的卵母细胞内。 • 以某一基因为探针分别探测另一基因的突变体和 野生型内某基因mRNA或蛋白质的定位，已查明 上述基因按一明确的顺序发挥作用。
• 在正常卵子内，mtrRNA仅位于卵裂期胚胎极质内 线粒体的外侧，以极粒的成分出现。mtrRNA与介 导极细胞的形成有关，但后来并没有进入极细胞内。
• 第四种极质成分是极粒组成部分但不翻译的一 种RNA (Polar granule component, pgc)。虽然 pgc的确切功能尚不清楚，但其反义DNA的转 基因果蝇的极细胞不能迁进卵巢(Nakamura et al., 1996)，可能与原始生殖细胞向生殖嵴迁移 有关。
• 另一母体效应基因无配子突变体，纯合♀蝇 突变体的后代其性腺内没有生殖细胞或者发 育异常。这里虽能形成正常数量的极细胞， 但受精后P颗粒很快退化而导致不育 (Engstrolu et al.,1982)。
2.1.1.4 极粒的主要成分与母体效应基因
• 线虫(Nematodes)，包括秀丽隐杆线虫和蛔虫在内， 其植物极细胞质的实质在很大程度上是不清楚的。 已有研究表明，RNA解旋酶(helicase)出现于它们 的极细胞质内。抗体研究提示，这种酶很可能是极 粒的组成成分。 • 然而，果蝇的相关研究进展较快，早在上世纪70年 代已分离得到极粒，主要由蛋白质和RNA构成， 都是母体效应基因的产物，但这些大分子的身份和 功能直到应用遗传学方法才逐步得到揭示。
第三次分裂时，动物极细胞沿子午线分裂而植 物极细胞仍沿赤道板分裂。然而第三次卵裂之 前，靠近动物极的那个植物分裂球在分裂后期 同样要进行染色体消减，故4细胞期唯有最植物 极那个细胞才具有完整的染色体组。 经过4次卵裂形成16个细胞后，其中仅2个细胞 保持4条染色体完整，将成为生殖干细胞；其余 细胞均含有消减染色体，便成为建立者细胞， 朝体细胞的方向分化发育。
• 生殖质或类生殖质在脊椎动物的卵子和胚胎中的 定域分布及其与生殖细胞决定的关系亦有研究报 道，尽管不及果蝇研究得深入。Bounoure曾证明 青蛙受精卵的植物极区含有一种物质，具有类似 于果蝇极质的染色特性。
• 昆虫卵子后端的极细胞质与生殖细胞决定相关 的现象最早由Hegner(1911)报道，他发现极细 胞形成之前，若除去或毁坏甲虫卵的极细胞质 区，胚胎发育就不能形成生殖细胞而导致成虫 不育。 • Geigy(1931)证明，用UV照射果蝇卵的极细胞 质则产生不育的果蝇。
• Okada和同事(1974)将供体正常的未经辐射的 极质注射到辐射过的受体卵的后端，结果能挽 救果蝇的不育性。该项研究还表明，极质以其 内含有颗粒状结构为特征，这些颗粒称为极粒 或P颗粒(Polar granules)，而其它部位的细胞 质则没有极粒，也不具有逆转其不育性的功能。 • 由此可见，极质内的P颗粒直接与生殖细胞决 定相关联。
Boveri并不满足于种系细胞发生的形态观察，他 还推测植物极细胞质区域内可能存在阻止染色体 消减的决定因子。假若如此的话，偶然进入该细 胞质区内的任何细胞核将避免染色体消减出现。
于是Boveri (1910)对马蛔虫受精卵在第一次卵裂 前进行离心干扰来检测他的假设。结果，离心处 理改变了纺锤体的方向，刚好与正常方向垂直， 致使两个分裂球都含有某些植物极细胞质而均不 发生染色体消减的现象。
角贝的受精卵在第一次卵裂前期，于植物极伸出一 个突起的泡状结构，称为极叶(Polar lobe)。第一次 卵裂完成后，一个子细胞得到全部极叶的细胞质， 另一个子细胞则不含极叶成分。第二次卵裂同样进 行。
经过多次卵裂之后，凡获得含极叶细胞质的子细胞 将分化成原始的生殖细胞，而不含极叶细胞质的子 细胞将朝体细胞的方向分化。 通过角贝卵裂过程中极叶的形态变化可以直接跟踪 观察和证明不对称细胞分裂与原始生殖细胞起源之 间的因果关系。
• 极质成份的第二组候选者是oskar和nanos等基因的产物， 其中OSKAR蛋白最关键，因为将oskar mRNA注射到 胚胎的其它部位就会导致该区域的细胞核形成异位的原 始生殖细胞。 • OSKAR还与生殖细胞产生的数量有关，如果卵母细胞 内的oskar mRNA增加就会形成更多的生殖细胞。 • OSKAR通过促成生殖细胞形成所必须的蛋白质和 RNAs的定位而发挥作用，nanos mRNA是受其作用的 RNA之一。
2.1 配子发生
• 配子发生涉及到原始生殖细胞起源的方式、途 径，参与调控、决定的有关基因。
• 原始生殖细胞独立于性腺原基产生，但必须迁 入性腺后才能完成增殖、生长和成熟等发育阶 段。
2.1.1原始生殖细胞的起源与决定
动物卵裂有多种方式和类型，因种类不 同而存在明显的差异。然而，无论采用哪种 卵裂方式，通过细胞不断分裂和增殖最终将 导致细胞之间的分化，首先是原始生殖细胞 从胚细胞中分化出来。
源自文库
• 这些研究表明：cappucino和spire指令合成的 两种蛋白质为STAUFEN蛋白定位后部所必需； STAUFEN又是oskar mRNA定位后部不可缺 少的。OSKAR是极粒的组成部分，同时又是 另一极粒组分VASA定位后部的关键所在。 tudor和valois不影响VASA的定位，但为极质 形成后保持其结构稳定不可或缺。