基因工程的基本工具和基本操作程序

3.(2009·安徽卷,4)2008年诺贝尔化学奖授予了 “发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学 家。如果将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因 连接起来组成一个融合基因,再将该融合基因转入 真核生物细胞内,表达出的蛋白质就会带有绿色荧 光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是( ) A.追踪目的基因在细胞内的复制过程 B.追踪目的基因插入到染色体上的位置 C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
提醒 该过程把三种工具(只有两种工具酶)全用 上了,是最核心、最关键的一步,在体外进行。
(3)将目的基因导入受体细胞
细胞 常用 类型 方法
受体 细胞
转化过程
植物 细胞
动物 细胞
微生 物细
胞
农杆菌 转化法
显微注 射技术
Ca2+处 理增大 细胞壁 通透性
体细胞
受精卵
原核 细胞 或酵 母菌
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 转入农杆菌→导入植物细胞→整合 到受体细胞的DNA上
盲目性
②人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和
反转录法。
化学合成法:蛋白质 分析 氨基酸序列 推测 RNA
碱基序列 推测 DNA碱基序列
用4种脱氧核
苷酸人工合成目的基因
反转录法:分离出供体细胞mRNA 逆转录酶 单链DNA
DNA聚合酶 合成目的基因
③PCR扩增技术与DNA复制的比较
PCR技术
将含有目的基因的表达载体提纯→ 取卵→获得受精卵→显微注射→早 期胚胎培养→胚胎移植→发育成为 具有新性状的动物
用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组 表达载体DNA分子与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收
提醒 ①唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。 ②微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛, 繁殖速度快,获得目的基因产物多。 ③植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。 (4)目的基因的检测和表达
文库类型 文库大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种之间的 基因交流
说明
cDNA文库 小 无 无
某种生物的部分基因
基因组文库 大 有 有
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本 操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优 点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 功能
大肠杆菌 连接黏性末端
T4噬菌体
连接黏性末端或 平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键
拓展提升 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA 连接酶
DNA 聚合酶
作用实质
都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯 键
(2009·江苏卷,34)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀 虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植 物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因), 据图回答下列问题。
(1)将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切
后
,
反应管中有
种DNA片段。
(2)图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接
(4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱 氧核苷酸序列,切割特定位点。 (5)切割方式 错位切：产生两个相同的黏性末端
平切：形成平末端
提醒 ①切割的化学键为磷酸二酯键。 ②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶, 目的是产生相同的黏性末端。 ③将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制 酶,同时产生4个黏性末端。 ④不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末 端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的 黏性末端不相同。
解析 将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连 接起来组成一个融合基因,将该融合基因转入真核 生物细胞内,表达出的蛋白质带有绿色荧光,从而 可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分 布。故C正确。 答案 C
知识综合应用
重点提示 通过“抗虫作物培育过程的有关基因工程知识”的
考查,提升“综合运用所学知识解决自然界和社会生活 中有关生物学问题”的能力。 典例分析
(4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织培 养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物——大 肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的胰 岛素则必需用真核生物酵母菌——需内质网、高尔基 体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营寄生生 活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它无细胞 核,不能合成蛋白质。
2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图
提醒 若题目强调“目的基因”的表达过程,则只 包括“转录和翻译”两个过程,不包括目的基因的 复制。
对位训练
1. 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和
表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。
下列属于目的基因检测和鉴定的是
( C)
①检测受体细胞中是否有目的基因 ②检测受体
细胞中是否有致病基因 ③检测目的基因是否转
录出了mRNA ④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A.①②③
B.②③④
C.①③④
D.①②④
2.科学家通过基因工程的方法，能使大肠杆菌产生
人的胰岛素。以下叙述错误的是
（ D）
A.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入
了重组质粒
B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
对位训练 4.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（ C ）
A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶 和载体
B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸 序列
C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快
D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达
5.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所
DNA复制
相 原理 同 原料 点 条件
DNA复制(碱基互补配对) 四种游离的脱氧核苷酸 模板、ATP、酶、原料、引物
解旋 方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
不 同
场所
体外复制(PCR扩增仪)
主要在细胞核内
点 酶 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA 片段
形成整个DNA分子
(2)基因表达载体的构建——最核心步骤 ①基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止 子以及标记基因等。
提醒 ①与载体相比较,增加启动子、目的基因和 终止子三个基因片段,其功能各不相同。 ②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子 (DNA片段)≠终止密码子(RNA)。 ②基因表达载体的构建方法
③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。
提醒 ①一般来说,天然载体往往不能满足人类的 所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某 些天然的载体进行人工改造。 ②常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色 的表达产物基因、发光基因等。 ③作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶 的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别 单一切点,若载体上有一个以上的酶切点,则切割 重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起 点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载
是否需模板
不需要
需要
连接DNA 链
作用过程
作用结果
双链
单链
将单个核苷酸加到已 在两个DNA片段之 存在的核酸片段的3′
间形成磷酸二酯键 端的羟基上,形成磷酸 二酯键
将两个 DNA片段 连接成重组 DNA
分子
合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ新的DNA分子
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)类型 最常用载体:质粒 其他载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等 提醒 ①质粒本质是DNA,不是细胞器;②特点:小 型环状。 (2)功能：将目的基因导入受体细胞。 (3)应具备条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； ②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源 基因连接；
第十单元 现代生物科技专题
第41课时 基因工程的基本工具和基 本操作程序
高频考点突破
考点一 基因工程的概念理解和理论基础 1.基因工程的概念理解
(1)操作环境：体外——关键步骤“表达载体的构 建”的环境。
(2)优点 ①与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。 ②与诱变育种相比：定向改造生物性状。 (3)操作水平：分子水平。 (4)原理:基因重组。 (5)本质:甲(供体提供目的基因) 乙(受体表达 目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合 成场所的转移。
C.DNA连接酶和限制性核酸内切酶都是构建重组
质粒必需的工具酶
D.目的基因的检测与鉴定表达过程中没有发生碱
基互补配对
考点二 基因工程的操作工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)化学本质：蛋白质。
催化作用,所以可重复利用 (3)作用
可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割
需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了
在受体细胞中表达的是
（ D）
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
解题思路探究
思维误区警示 易错分析
基因工程中易错点辨析不清
(1)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。 (2)工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型DNA分 子,但不一定是环状。 (3)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否 导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基 因,表达产物为带颜色物质等。
纠正训练
1.(2009·浙江卷,3)下列关于基因工程的叙述,错误
的是
()
A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工
具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原
无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞
和促进目的基因的表达
解析 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自 动、植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸内 切酶和DNA连接酶;人胰岛素原基因在大肠杆菌中 表达的胰岛素原无生物活性,只有经过一定的物质 激活以后,才有生物活性。载体上的抗性基因主要 是有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基 因的表达。所以D错误。
酶
连接的过程,此过程可获得
种重组质粒;
如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切,目的基因与质粒连
接后可获得
种重组质粒。
(3)目的基因插入质粒后,不能影响质粒的
。
(4)图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白,可以协助
带有目的基因的T-DNA导入植物细胞,并防止植物
(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠
上皮细胞表面的特异受体,使细胞膜穿孔,肠细胞
裂解,昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对
较小,原因是人类肠上皮细胞
。
(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混
合播种,其目的是降低害虫种群中的
基
因频率的增长速率。
解析 本题重点考查转基因技术的相关知识,需特 别注意基因工程的步骤、DNA的复制、基因工程的 操作工具等知识。本题需特别注意图示过程,从中 获取有效信息,然后结合课本知识即可正确解答。 答案 (1)4 (2)2 1 (3)复制 (4)DNA水解酶 (5)表面无相应的特异性受体 (6)抗性
二酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新
形成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接
起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行 连接
考点三 基因工程的基本操作程序 1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程
2.基本操作程序 (1)目的基因的获取 ①从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取
答案 D
2.(2009·重庆卷,2)下表有关基因表达的选项中,不
可能的是
()
基因
表达的的细胞 表达产物
A 细菌抗虫蛋白基因 抗虫棉叶肉细胞 细菌抗虫蛋白
B 人酪氨酸酶基因 正常人皮肤细胞 人酪氨酸酶
C
动物胰岛素基因
大肠杆菌工程菌 细胞
动物胰岛素
D 兔血红蛋白基因 兔成熟红细胞 兔血红蛋白
解析 细菌抗虫蛋白基因可通过转基因技术转入 棉花体内,在棉花的叶肉细胞中表达产生细菌抗虫 蛋白,使棉花具有抗虫能力;人酪氨酸酶基因可在 正常人的皮肤细胞中表达产生酪氨酸酶,酪氨酸酶 催化酪氨酸转化为黑色素;动物胰岛素基因可通过 转基因技术转移到大肠杆菌体内,在大肠杆菌工程 菌细胞中合成动物胰岛素;兔属于哺乳动物,其成 熟的红细胞中没有细胞核,所以不可能表达出血红 蛋白。 答案 D
体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把 环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。 ④注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和 作用都不相同。 ⑤质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞也 可在体外复制。
对位训练 3.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是
（ B） A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸