质谱在单克隆抗体方面的应用

本研究先用NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺） 封闭样品的游离巯基，再经8M Urea变性处理 后，用Lys-C 和Trypsin 依次酶切，得到第一组 非还原待析样品（非还原样）。部分酶切样品
再用还原剂TCEP还原，得到第二组待析样品（ 还原样）。
单抗直接经胰蛋白酶酶解后，有些肽段仍然 通过二硫键连接在一起，通过对二硫键连接肽 段的鉴定可验证单抗的二硫键连接方式。
三、质谱的结构
进样系统
离子源
质量分析器
离子检测器
A. 气体扩散 B. 直接进样 C. 气相色谱
A. 电子电离源EI B. 化学电离源CI C. 快原子轰击源FAB D. 电喷雾源ESI E. 大气压化学电离源APCI F. 场致电离源FI G. 基质辅助激光解吸电离源 MALDI
A、磁式单聚焦分析器 B、磁式双聚焦分析器 C、四极杆分析器 D、离子阱分析器 E、飞行时间分析器 F、傅立叶变换回旋共振分析器
质 CZE 性
电荷异质体表征
HPLC 硼酸亲和色谱 cIEF CEX-HPLC(%) CZE(min) LC/MS/MS
表 征
研究项目
生物活性
抗原亲和力/解离力
与含有表面抗原细
活 胞的亲和力
性 FcγR亲和力
检 测
FcRn亲和力
C1q亲和力
CDC
ADCC
凋亡
纯度，SEC-HPLC （%） 产 品 纯度，非还原CE相 SDS 关 杂 纯度，还原CE-SDS 质 脱酰胺产物，RP-
用Lys-C酶解后的肽段进行反相UPLC分离， 通过与理论酶切肽段分子量比对，确定样品氨基 酸序列与理论序列的一致性。
液质联用（LC/MS）技术在曲妥珠单抗结构表征上的应用，Henry Shion等，Waters Corporation
应用四 肽图CDR区定位
亚基 LC
CDR区 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1
HPLC
工 HCP残留 艺 相 ProteinA残留
关
杂 DNA残留 质
生 内毒素 物 负 无菌 荷
方法
细胞法 ELISA Kd, SPR, ForteBio Octet
FACS(EC50 μg/ml)
FACS(EC50 μg/ml) FACS(EC50 μg/ml) FACS(EC50 μg/ml) EC50 EC50 FACS 单体纯度，高分 子量杂质 低分子量杂质 轻链+重链纯度， NGHC
蛋白质药物N端氨基酸序列可由肽谱结合二级质谱信息加以确认。序列末端肽段经反相色谱分离，通过质谱检测其精 确分子量。母离子在质谱碰撞室中与惰性气体发生碰撞，得到的碎片离子质量包含肽段的序列信息，通过和理论序列 信息比对，可确定单抗样品的轻链和重链N末端序列与理论序列是否一致。
应用三 肽段覆盖率
两个批号次曲妥珠单抗LC/MS 肽图镜像比较结果图。
电荷异质性
质谱应用
糖基化
• 糖基化位点 • 糖链结构分析
应用一 分子量测定
ESI-TOF
单克隆抗体精确完整wenku.baidu.com子量测定图。
单克隆抗体精确亚基分子量测定图。
TripleTOF®高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链分析中的应用
应用二 N/C端氨基酸测序
目前N末端序列分析大多采取Edman降解法，但Edman降解法不能解决N 端封闭和蛋白质修饰的测序问题，而质谱法测序则不受限制。蛋白质的C末 端分析，并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析。无论是国内要求 ，还是国外药典，现阶段都是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。
2002年诺贝尔化学奖获得者
日本科学家田中耕一(Koichi Tanaka)1959年出生于日本富山 县首府富山市，1983年获日本 东北大学学士学位，现任职于 京都市岛津制作所，为该公司 研发工程师，分析测量事业部 生命科学商务中心、生命科学 研究所主任。他对化学的贡献 类似于约翰·芬恩，因此也得到 了1／4的奖金。（MALDI）
*毛细管区带电泳（CZE）
毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis）也被称为自由溶液电泳； 主要用于分离带电化合物，不能分离中性化 合物； 主要以溶质的电荷/体积比的不同，因而迁移 速度不同进行分离； 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢 量和。溶质的流出顺序：阳离子＞中性粒子＞ 阴离子； 可用于分离单克隆抗体的电荷异构体。
2、质谱-质谱联用
两个或更多的质谱连接在一起，成为串联质谱。最简单的串联质谱（ MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器将离子预分离或 加能量修饰，由第二个质量分析器分析结果。
常见的形式有串联（多联）四级杆质谱、四级杆离子阱质谱、四级杆和磁 质谱混合式串联质谱和采用多个扇形磁铁的串联磁质谱。 特别适合于复杂组分体系且干扰严重的样品中低含量组分分析测定，具有 比GC-MC和LC-MS等一级质谱更高的选择性和灵敏度。
Ellman’s Test(mol/mol)
圆二色性
圆二色谱（%）
高 拉曼光谱
级 结
荧光光谱
构 核磁共振
热稳定性
DSC
表 征
研究项目
糖基化位点
糖 糖链结构分析 基 化 寡糖图谱
方法
肽图， LC/MS/MS LC/MS/MS
HILIC，荧光
唾液酸含量
糖 化
糖化
pI及不同pI组分的相 对含量 电
荷 电荷异构体分布 异
重组嵌合抗CD20 IgG1 型单克隆抗体的结构验证，陶磊等，药学学报，2010，45（6）
应用七 糖链结构分析
对于游离N-寡糖的分析，通过PNGase F酶将单抗中的N-连寡糖释放出来，游 离的寡糖先用2-AB（ 2- 氨基苯甲酰胺）进行标记，然后再使用亲水作用色谱（ HILIC）进行分离并使用荧光和串联四极杆飞行时间质谱进行检测。通过寡糖的 准确分子量确认糖的类型。
美国科学家约翰·芬恩1917年出生于 美国纽约市，1940年获耶鲁大学化 学博士学位，1967年到1987年间任 该大学教授，1987年起被聘为该大 学名誉教授，自1994年起任弗吉尼 亚联邦大学教授。他因为“发明了
对生物大分子进行确认和结构分析
的方法”和“发明了对生物大分子
的质谱分析法”而获得今年诺贝尔 化学奖1／4的奖金。（ESI)
图A：UPLC/FLR/Xevo QTof MS 分析源自曲妥珠单抗的经2-AB 标记的寡糖。左侧上图 是FLR 色谱图；左侧下图是MS 的TIC （总离子流）图。
液质联用（LC/MS）技术在曲妥珠单抗结构表征上的应用，Henry Shion等，Waters Corporation
应用八 电荷异质体表征
应用九 液质联用法鉴定、定量宿主细胞蛋白
细胞系表达出的蛋白，采用柱纯化，加入已知浓度外源蛋白用于验证方法正确性。 第一维反相，第二维反相。Hi3蛋白定量方法是基于MSE串联质谱方法的非标定量蛋白技 术。分析时首先使用2D nano LC-MSMS液质平台以及Hi3方法对杂质蛋白进行鉴定及定量 ，进行方法开发，之后再使用1D UPLC MRM（多离子反应监测）方法进行大批量样品检 测。
1、色谱-质谱联用
A、气相色谱－质谱（GC-MS）：应用十分广泛，从环境污染分析、食品 香料分析鉴定到医疗检验分析、药物代谢研究等。而且GC-MS联用是国际奥 委会进行兴奋剂药检的有力工具之一。
B、液相色谱－质谱（LC-MS）：适用于热稳定性差、不易汽化的样品。
C、毛细管电泳－质谱（CE-MS）：CE-MS是色质联用中新的发展方向， 其中应用最成熟的是CZE*-MS。
瑞士科学家库尔特·维特里希 1938年生于瑞士阿尔贝格， 1964年获瑞士巴塞尔大学无 机化学博士学位，从1980年 起担任瑞士苏黎世联邦高等 理工学校的分子生物物理学 教授，还任美国加利福尼亚 州拉霍亚市斯克里普斯研究 所客座教授。他因“发明了 利用核磁共振技术测定溶液 中生物大分子三维结构的方 法”而获得2002年诺贝尔化 学奖一半的奖金。
A.电子倍增器 B. 闪烁计数器
四、质谱联用技术
色谱-质谱联用：质谱仪是一种很好的定性鉴定用仪器，对混合 物的分离无能为力。色谱仪是一种很好的分离用仪器，但定性能力 很差，二者结合起来，则能发挥各自专长，使分离和鉴定同时进行 （色谱-质谱联用）。 质谱-质谱联用：为了增加未知物分析的结构信息，增加分析的 选择性，采用串联质谱法（质谱-质谱联用），也是目前质谱仪发 展的一个方向。
质谱保留时间（min)
34.62 64.36 71.18 36.34
21.02 5.52
23.01 68.39
UV保留时间（min）
比质谱保留时间提 前约0.1min
应用五 二硫键定位
对于抗体大分子而言，其三维结构由四条肽 链通过多个链间或链内二硫键连接形成，对其 二硫键分析可进而了解其三级结构的情况，是 其表征研究的重要内容。
应用六 糖基化位点
通过将单克隆抗体用蛋白酶酶切，肽段经 LC-MS分离检测，比较单抗切除糖链前、 后的液质肽图，将上述可能发生的糖型设 置为可变修饰进行数据检索，可以确认糖 基化修饰位点。
单抗氨基酸序列中只有一个N-糖序列子结构(NST), 位于重链肽段 T23。在单抗切除糖链前、后所得液质肽图中, 分别发现了含糖链 的肽段T22-T23及不含糖链的肽段T23 (图4), 因此将糖基化位点定 位于肽段T23 中的Asn301。
质谱与蛋白质
对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edman sequencing，或是二维 凝胶电泳技术。但利用这些技术花费的时间较长； 但从前质谱仅运用于小分子，因为在进行质谱分析时，必须将分子气化及带 上电荷，对于较小的分子而言，并不是相当困难，然而对于大的生物分子（如 蛋白质分子），要将分子气化及带电，同时不能伤害分子的完整性，非常不容 易。 1960~1980年，科学家发展出许多方式，尝试将生物大分子从液相游离化成为 气相分子，例如比较早期的化学游离法、或是电浆游离法。但是这些方法只能 应用到10kDa以內的分子，对于动辄数百至数千kDa的蛋白质大分子来说，仍不 适用。
质谱与单克隆抗体
表 征
研究项目
分子量（完整分子、 轻链及重链）
氨基酸序列
一 脱酰胺/氧化
级 结 构
N末端焦谷氨酸环化 比率（轻链、重链）
C末端测序及Lys缺
失比率
二硫键定位
自由巯基定量
方法
LC/MS(Da）
肽段覆盖率、肽 图， LC/MS/MS(%) 肽图， LC/MS/MS(%) 肽图， LC/MS/MS(%) 肽图， LC/MS/MS(%) 非还原肽图， LC/MS/MS
CDR2 HC
CDR3
肽段标签 L:T2 L:T3 L:T5
L:T7
H:T3 H:T5 H:T6 H:T7 H:T8 H:T11
H:T12
酶解肽段
VTITCR ASQDVNTAVAWYQQKPGK LLIYSASFLYSGVPSR SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQHYTTPPTFGQGTK DTYIHWVR GLEWVAR IYPTNGYTR YADSVK GR AEDTAVYYCSR WGGDGFYAMDYWGQGTLVT VSSASTK
mol/mol,%
ELISA ELISA
Real time PCR
鲎试剂
薄膜过滤
质谱与单克隆抗体
• 分子量（完整分子、轻链及重链）
• 氨基酸序列 • 二硫键定位
一级结构
• N末端焦谷氨酸环化 •链间二硫键位置的谷胱甘肽化 •Fc段的唾液酸化 •脱酰胺 •糖化 •链间二硫键的半胱氨酸化 •天冬氨酸向琥珀酰亚胺的转变 •Fc段的非糖基化 •糖基变化 •C端的赖氨酸变体和酰胺化
质谱简介
一、质谱的概念
二、质谱的特点
质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器(Thompson)．但实际上质 谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/z or m/e)；
质谱法应用范围广，可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构 及化学特性的确定等方面；
所需化合物的量非常低：10-12g, 或10-15 mole； 对样品有破坏性； 分析速度快； 仪器结构复杂，价格昂贵，使用及维修比较困难。
通过对液质肽图 (图2) 进行解析, 共发现5 种链内二硫键连接肽段: 2 种 位于轻链 (T2-T5; T9-T16), 3 种位于重链(T2-T9; T20-T26; T34-T39), 由 于单抗含有2 条轻链和重链, 因此对单抗10 条二硫键的配对方式进行 了验证。
重组嵌合抗CD20 IgG1 型单克隆抗体的结构验证，陶磊等，药学学报，2010，45（6）