食品中微生物检验方法

ISO4833-2003 菌落总数测定流程
如果怀疑样品中含有 在培养基表面蔓延生 长的菌落，待琼脂凝 固后，在其上覆盖一 层（4mL）水琼脂。
检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行）
每皿内加入适量（12~15mL） 平板计数琼脂（PCA），
❖ 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
菌落总数测定——卫生学意义
❖ 判定食品被细菌污染的程度及卫 生质量。
❖ 及时反映食品加工过程是否符合 卫生要求，为被检食品卫生学评 价提供依据。
❖ 通常认为，食品中细菌数量越多， 则可考虑致病菌污染的可能性越 大，菌落总数的多少在一定程度 上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行）
每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 ℃ ，48 ± 2h
菌落计数
FDA BAM 菌落计数方法
❖ 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d
❖ 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count
❖ 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml （g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
30±1 ℃ ，72 ±3 h
菌落计数
Biblioteka Baidu
平板叠放不 超过6个
ISO4833-2003菌落计数方法
❖ 选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板 至少含15CFU进行计数，计算公式如下： N=∑C/（n1+0.1*n2）*d
❖ 所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术 平均值m，液体样品：NE=m 固体样品： NE=m×d-1
❖ 无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 ×d-1
❖ 最终结果保留前两位有效数字。
❖ 由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是 样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、 厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映 出来。
❖ 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、 葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落 可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平 板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重 量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位 （colony forming units，CFU）报告。
❖ 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm 的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应 平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞ 65*100* 1/d。
❖ 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 ❖ 最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
❖ 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可 作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃ 放置，以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
❖ 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
❖ 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学 方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为 食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些 细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步 的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗 称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和 阴沟肠杆菌等。
❖ 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科， 归属于埃希氏菌属。
❖ 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产 气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验） 为++--或-+--的细菌。
❖ 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括 五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠 杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
❖ 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充 分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后， 不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。
❖ 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、 平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打 开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了 解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
大肠菌群和大肠杆菌的关系
耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中35/37 ℃ 培养48h产 酸产气，并在44.5℃培养24h产酸产气的细菌（依据ISO标准）
卫生学意义
❖ 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪 便污染指标。
❖ 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病 菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康 危害性的大小。
内容提要
❖ 菌落总数检测 ❖ 大肠菌群及大肠杆菌
检测 ❖ 金黄色葡萄球菌检测 ❖ 沙门氏菌检测 ❖ 单核细胞增生李斯特
氏菌检测
菌落总数测定——菌落总数的概念
❖ 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、 容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某 种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成 的菌落的总数。