第六章 生物酶工程

③启动子同克隆基因间距离（由于mRNA的5’端形成不同的二级结 构，影响mRNA的翻译效率）
④质粒拷贝数及稳定性（增加相应的mRNA分子数量）； 还 有，宿主对目标基因密码子的偏好、细胞的代谢负荷及表达蛋白质 的稳定性、表达条件等因素

Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
2.昆虫表达系统

载体：昆虫病毒（如昆虫杆状病毒），穿梭载体（在细菌和昆虫细 胞间穿梭）

同 源 重 组
Enzyme Engineering 第一节
优点：
①可对蛋白质进行翻译后加工修饰
酶基因的克隆和表达
②可高水平表达外源基因产物
（一）

酶分子的改造 酶分子定向进化的基本方法
酶定向进化的基本步骤：
① 通过随机突变和体外重组创造基因多样性；
② 导入适当载体构建突变文库； ③ 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
Enzyme Engineering 第二节
③化学合成法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短） ④cDNA文库
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
基因文库（genomic library）构建
Enzyme Engineering 第一节
2.
酶基因的克隆和表达
克隆载体的选择
繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子
Enzyme Engineering
酶 工 程
Enzyme Engineering
第六章 生物酶工程
Enzyme Engineering 第一节

酶基因的克隆和表达
一、酶基因的克隆 在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复 制能力的DNA分子，即重组载体，然后通过转化或转染等 方式将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因 的转化子细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基 因。

Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
二、酶的定向进化

模拟天然酶的自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，产生基因 多样性，再通过定向筛选（选择）获取具有特定性质的突变酶的过 程或技术，称为酶的定向进化 定向进化 = 随机突变 + 定向选择

Enzyme Engineering 第二节
Enzyme Engineering 第二节
4.

酶分子的改造
交错延伸法

是一种改进的或简化的DNA改组法，在PCR反应中，将含不同点突 变的模板混合，加入单引物，进行多轮变性、短暂的复性/延伸，反 复重复直到形成全长基因片段 （二） 酶分子定向进化的应用
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
一、酶的定点突变

定点突变是指在基因的特定位点引入突变，即通过取代、 插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶 蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，以此来改善酶的 特性
利用一段人工合成的含有点基因
突变的双链寡核苷酸片段，直接
取代野生型基因中的相应序列， 从而获得突变基因

特点：简单易行，突变效率高，可
以在限制酶切位点内进行一次突变 而获得多个突变位点。但靶DNA区段 两侧必须存在一对限制酶单切位点。
Enzyme Engineering 第二节
(四)
酶分子的改造

酶分子的改造
1. 易错PCR
通过使用低保真度的TaqDNA聚合酶或改变PCR常规反应条件，如 调整反应体系中四种dNTP的浓度（增加突变频率）、增加Mg2+的 浓度（以稳定非互补的碱基对）、添加Mn2+ （降低聚合酶对模板的 特异性）等，引起碱基以某一频率产生随机错配而引入多点突变， 构建突变库，筛选所需突变体。
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第一节
2.

酶基因的克隆和表达
影响原核生物基因表达系统表达效率的因素
①启动子结构（强启动子比如大肠杆菌lacP、trpP，人工构建的 tacP等） ②转译起始序列（SD序列的保守性、SD序列后面的4个碱基成分以 及起始密码子AUG左侧的密码子的碱基组成都会影响到外源基因的 表达效率）
③操作相对简单（已经商品化） ④蛋白准确定位（如分泌到胞外）
Enzyme Engineering 第一节

酶基因的克隆和表达
3.哺乳动物表达系统
载体：
哺乳动物细胞质粒表达载体，动物病毒
特点：
表达最接近天然的重组蛋白质 重组蛋白的产量较低 直接利用宿主细胞研究重组蛋白的功能 可用于基因治疗
4.

酶基因的克隆和表达
重组载体导入受体细胞
导入原核受体细胞方法：氯化钙法、电穿孔法、转导等
导入真核受体细胞方法：
酵母细胞：原生质体转化法 动物细胞：电穿孔法、微量注射法 植物细胞：Ti 质粒转化法、基因枪法
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
二、酶基因的异源表达
（一）外源基因在原核细胞中的表达
1. 原核生物基因表达系统的特点——大肠杆菌
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
只有一种RNA聚合酶 表达以操纵子为单位 转录与翻译偶联 不含内含子，缺乏内含子切除系统 表达调控在转录水平 mRNA上含有SD序列
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目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
理想克隆载体的要求：

① 是一个独立的复制子，有复制起始序列，可在宿主细胞中独立自 主复制 ② DNA上有若干合适的限制性核酸内切酶位点，便于外源DNA的 插入 ③有易被识别筛选的标志基因


Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
1.酵母表达系统

大肠杆菌/酵母穿梭载体：通常在原核细胞中用于克隆基因，在真核 细胞中用于基因表达分析
① 原核质粒序列——复制起始序列和抗药性基因标记 ② 在真核细胞中表达重组基因所需元件——启动子、增强子、转录终 止子和加polyA信号序列、mRNA剪接信号序列、标志基因、单一 限制性内切酶位点
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达 DNA重组技术的发现
1972年，世界上第一个重组DNA分子诞生
1980年，获诺贝尔化学奖
Enzyme Engineering 第一节

酶基因的克隆和表达
（一）酶基因克隆的主要操作步骤
1.
目的基因的分离获取
2.
3. 4. 5.
载体的选择与准备
目的基因与载体连接 重组基因转入受体细胞 重组体的筛选与鉴定
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
Enzyme Engineering 第一节
1.

酶基因的克隆和表达
目的基因的获取
①PCR——待扩增目的基因两端序列已知（据此设计引物）
②基因文库——先构建，再筛选
Enzyme Engineering 第一节
5.

酶基因的克隆和表达
重组子的筛选与鉴定
① 根据载体的选择标志初步筛选（比如抗生素抗性、蓝白斑筛选等)
② PCR 法
③ 核酸杂交法 ④ 免疫学方法——放射性免疫法和酶联免疫法 ⑤ DNA限制性内切酶图谱分析法 ⑥ 核苷酸序列测定法
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
Enzyme Engineering 第二节
优点：

酶分子的改造
①同时进行多达5个点突变
②采用高保真PfuTurbo® DNA聚合酶，确保扩增过程的高准确性， 无预期外的随机突变错误
③快速简单的3步操作，一天内完成 ④每个突变位点使用一个带突变的寡核苷酸引物，节省引物费用 ⑤可使用简并寡核苷酸引物 ⑥含有高转化效率的XL-10 Gold® 超级感受态细胞

④ 安全，不含对受体细胞有害的基因
Enzyme Engineering 第一节
3.

酶基因的克隆和表达
目的基因与载体连接
① 用T4或E.coli DNA连接酶可连接互补黏性末端
② 用T4 DNA连接酶连接平端
③ 先在DNA片段末端加入人工接头，形成黏性末端再进行连接
Enzyme Engineering 第一节
是不是所有基因都可以在E.coli中表达？

必要条件：
①删除内含子和5'非编码区
②需要强启动子和SD序列 ③维持正确开放阅读框 ④mRNA稳定，形成的蛋白质不被降解 ⑤蛋白不需翻译后加工
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
（二）外源基因在真核细胞中的表达
3
3
重组PCR定点突变示意图
Enzyme Engineering 第二节
3 5
酶分子的改造
5 引 物 A PCR 1 5 3 模 板 DNA
引 物Hale Waihona Puke BaiduB
3 5 5
5 3 引 物 C 3 5 3 5 PCR 2
5 3
大引物PCR定点突变示意图
Enzyme Engineering 第二节
（三）
酶分子的改造 盒式突变
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
（一）寡核苷酸引物突变

通过聚合酶的作用启动DNA分子进行复制，用含有特定核苷酸改变 （突变）的寡核苷酸片段作为引物合成DNA子链的其它部分
① ② ③ ④
基本步骤：
将待突变基因克隆到突变载体上 制备含有待突变基因得单链模板
突变寡核酸引物与待突变基因的核苷酸形成一小段碱基错配 的异源双链DNA 合成突变基因；⑤ 转化和筛选。
按功能 克隆载体（用于获得目的DNA片段） 表达载体（获得目的DNA片段所编码蛋白质)
载体：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细胞的无性 分类：
按基本元件来源
质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等
Enzyme Engineering 第一节 酶基因的克隆和表达
特点：保真度高，操作复杂
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
（二） PCR
3 5 PCR 1 5 PCR 2 5 引 物 B 5 PCR 2 引 物 C 5 混 合、 变性 、 退火 3 5 PCR 3 3 5 PCR 4 引 物 B 和C 5 3 3 5
突变
5 引 物 A 引 物 A 5 PCR 1 5 3 模 板 DNA
Enzyme Engineering 第二节 酶分子的改造
特点： DNA片段得以重新组合，能在较短的时间内获得性能明显 改善的酶蛋白，同时可使酶的两个或更多的已优化性质合为一体。
Enzyme Engineering 第二节
3.
酶分子的改造
随机引物体外重组法
以单链DNA为模板，利用一套随机序列引物进行PCR扩增，就可以 产生大量和模板不同位点互补的短片段。由于碱基的错配和错误引 发，这些短的DNA片段会含有少量的点突变。进一步PCR 反应中， 它们之间可以相互同源引导和重组。组装成完整的基因长度，再利 用末端序列为引物扩增得到全长基因。

特点： 能够控制突变频率 缺乏重组机制，核苷酸序列分布的多样性不够
Enzyme Engineering 第二节
2.

酶分子的改造
DNA改组
从正突变基因库中分离出所需的DNA片段，利用DNaseⅠ或超声波 进行切割产生随机大小DNA片段，得到的随机片段在不加引物的多 次PCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为 接近目的基因长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩 增获得全长基因，这是来自不同基因的片段之间的重组。