生物样品预处理
生物样品预处理
生物样品预处理的应用与发 展趋势
第六章
生物样品预处理的应用领域
医学领域：用于疾病诊断、治疗和 药物研发
环境监测领域：用于水质、空气和 土壤等环境因素的监测
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农业领域：用于农产品质量检测、 育种和病虫害防治
食品安全领域：用于食品添加剂、 农药残留和重金属等检测
生物样品预处理的发展趋势与展望
对于不同种类的生物样品，要分别 处理，避免交叉污染。
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在操作过程中，要遵循无菌操作原 则，避免微生物、细菌等污染样品。
在处理过程中，要定期对操作台、 器具等进行清洁和消毒，保持清洁 卫生。
保证操作的安全性
生物样品具有潜在危险，操作时应佩戴个人防护装备 遵循实验室安全规定，确保工作环境安全 避免交叉污染，确保生物样品处理过程中的安全 正确使用和处理化学品，确保操作的安全性
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实验要求：严格遵守操作规程，保 证实验结果的准确性和可靠性
实验步骤：按照操作规程进行实验， 记录实验数据并进行分析
检测方法与仪器
检测方法：生物样品预处理的方法应根 据检测目的和要求选择，常用的检测方 法包括光谱分析、色谱分析、质谱分析 等。
仪器选择：根据检测方法和生物样品的特 性，选择合适的仪器进行预处理，如离心 机、过滤器、萃取装置等。
仪器精度：仪器的精度对预处理结果的影 响较大，应选择精度高、稳定性好的仪器。
仪器维护：仪器的维护和保养也是影响 预处理效果的重要因素，应定期进行维 护和保养，确保仪器的正常运行和使用 效果。
操作人员技能与素质
生物样品预处理技术
取500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充 分捣碎均匀；
样品均匀化
取2g 捣碎样品，加入8ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)，再
• 固相萃取
• • • • • • • 操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者 浓缩后进样 与色谱理论相同
二、生物样品预处理方法
二、生物样品预处理方法
• 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取的优点：
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉
有机强酸
季铵碱、盐
有机酸、酚类
示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法
• A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 批号：03050803 • 3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷 Mr390 • • B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 • 2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷 Mr406
• 萃取效率高
• 处理速度快，具有一定通量 • 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换 作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合 • 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱: 对有机酸、酚类 对有机强酸 对季铵碱、盐 pKa 2-8 pKa 2-10 pKa <1.0 pKa >10 选择 Oasis® MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
• 储存条件
–20℃：大部分药物 –80℃：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等
生物样品的采集制备和预处理
生物样品的采集制备和预处理生物样品的采集制备和预处理一、生物样品采集1、植物样品的采集（1）采集的植物样品要具有代表性、典型性、适时性。
（2）布点方法常采纳梅花形五点取样法或交叉间隔取样法。
（3）采样方法①采样前应预先准备好采样工具。
②依据实际情况确定样品采样量。
③选择优势莳植物在采样区内按梅花形五点或交叉间隔取样方式采集5－10处的植株混合构成一个代表样品。
④将采好的样品装入布口袋或聚乙烯塑料袋中，贴好标签，并填写采样登记表。
2、动物样品的采集（1）尿的采集定性检测尿液成分时应采集晨尿。
定量检测尿液成分时一般采集24h总排尿量。
（2）血液的采集一般用注射器抽取10mL血样冷藏备用。
常用于分析血液中所含金属毒物及非金属毒物。
（3）毛发和指甲的采集采集和保存较为便利，重要用于汞、砷等含量的测定。
（4）组织和脏器采集二、生物样品的制备对于液体状态的动物样品常无需制备，对动物组织和脏器重要是采纳捣碎的方法制成浆状鲜样备用，而对植物样常依据不怜悯况，利用不同方式进行样品制备。
植物样品的制备（一）平均样的获得四分法、切成块的1/4－1/8混合（二）分析试样的制备1、鲜样2、风干样：60－70摄氏度低温真空干燥箱中烘干（匀浆、小片）3、水分含量测定（100－105摄氏度烘干/真空干燥/低温烘干）三、生物样品的预处理常用的预处理方法有湿法消解法、灰化法、提取、分别和浓缩法等。
1、湿化消解法利用强酸等与生物样品共同煮沸，将样品中有机物分解成二氧化碳和水除去。
常用的消解试剂体系有浓硝酸－高氯酸、浓硝酸－浓硫酸、浓硫酸－过氧化氢等。
2、灰化法利用坩埚或氧燃烧瓶，使样品在高温条件下分解，并用适当的溶液溶解或汲取分解产物，制成分析试液。
3、提取法整个过程包括提取、分别、浓缩三个步骤。
（1）提取应依据样品的特点、待测组分的性质、存在形态和数量、分析方法等因素选择，常用方法有：1、振荡提取法2、组织捣碎提取法3、脂肪提取器提取4、直接球磨提取法（2）分别用提取剂从生物样品中提取欲测组分的同时，不可避开的会将其他相关组分提取出来，因此，在测定之前，还必需将上述杂质分别出去。
生物样品预处理技术
对季铵碱、盐 对有机酸、酚类
pKa 2-10
pKa <1.0
pKa >10
pKa 2-8
选择 Oasis® MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
套用方法1
样品预处理
激活/平衡 上样
清洗: 2% 甲酸
淋出段 1: 100% MeOH
淋出段 2: 5% 氨℃：阿莫西林等抗生素 ✓ 加稳定剂：卡托普利等 ✓ 立即测试：维生素C等
一、生物样品的一般处理原则
• 生物样品均匀化
• 体液样品： 尿液、血浆——涡旋混匀
• 固体样品： 组织、粪便——加入适量溶剂进行高速匀浆
一、生物样品的一般处理原则
• 结合物水解
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉 • 萃取效率高 • 处理速度快，具有一定通量
• 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换
作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合
• 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱:
对有机强酸
中性物质
套用方法2
样品预处理
• Ⅱ相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物 • 极性大、亲水性、不易于提取富集
• 酸水解：简便、快速，不具备专一性，注意药物是否 被破坏
• 酶水解：β-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间 长，实验费用高
二、生物样品预处理方法
• 预处理的目的： 去蛋白，释放药物 样品纯化和富集 满足分析方法灵敏度的需要 防止分析仪器的污染和劣化 满足大量样品分析的需要 微量、快速
• 溶剂的选择与纯度的要求 • 有机溶剂相和水相的体积 • 水相的pH 值
生物样品预处理
2 干灰化法（Dry Ashing）将生物材料样品置于坩埚中，蒸发至干并炭化，然后在高温炉（马弗炉）中灼烧使灰化，直至样品中的有机物全部分解成为白色残渣为止，这样的处理方法称为干灰化法。
其一般操作步骤分为干燥、炭化、灰化和溶解灰分几个过程。
待灰化样品必须先行干燥，否则在高温下易发生暴溅，使样品丢失或玷污。
另外，需注意某些元素的气化损失。
灰分是指样品经过灼烧后残留的无机物。
为各种矿物元素的氧化物。
主要元素有Ca、Mg、K、Na、Si、P、S、Fe、Al、I等，此外，尚有微量元素，总数不少于60余种。
碳化dry distillation；carbonization；carbonification，碳化同炭化。
又称干馏(dry distillation)。
有机化合物在隔绝空气下热分解为碳和其他产物，以及用强吸水剂(浓硫酸)将含碳、氢、氧的化合物(如糖类)脱水而成炭的作用也称碳化。
按照灰化方式不同，可将干灰化法分为高温分解法和低温灰化法。
⑴高温分解法（Decomposition Method in High Temperature）属于这一类的干灰化法有以下3种。
①常压高温分解法将经粉碎或匀浆的样品置于铂、镍、银或瓷坩埚中，先在一定温度下干燥并炭化，再置于高温电炉中灼烧至样品灰分呈白色或浅灰色，经溶解、定容，供分析测定。
②高压干灰化法高压干灰化法在氧弹中进行。
氧弹结构如图所示：图1.1 氧弹结构如图氧弹能抗高压，外壳为不锈钢。
对某些特殊组分，如氟的测定，要求用铂衬里，以避免腐加速溶剂萃取系统由压力控制泵、气路、不锈钢萃取池、加热炉及萃取收集器等部件组成。
该系统适用于固体或半固体样品的预处理，尤适用于组织块类生物材料样品中有机磷、有机氯、其它有机农药、多氯联苯、多环芳烃等组分的分离测定。
其装置模似图及运作流程见图：操作时先将样品装入萃取池，向萃取池加注溶剂后提高萃取池的温度和压力，以压缩气体（如N2）将待萃取组分吹入收集瓶，以供分析测定。
生物样品预处理.
三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
操作：先将被测组织加Tris-缓冲液pH 10.5及酶， 60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液， 即可供药物提取用。 优点：可避免某些药物在酸及高温下降解；对与 蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英钠）， 可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取 酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检 测时，无需再进行过多的净化操作。
二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率：
a.结合蛋白率高: 首先去蛋白 b.多为代谢缀合物：缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性：涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。 紫外吸收强弱：是否用UV检测器 含有-NO2 、-Cl等电负性基团：ECD检测器
三、常用的处理方法
常用方法
1.有机破坏法 2.除蛋白法 3.缀合物的水解 4.分离，纯化 与浓集 5.衍生化法
重点介绍
除蛋白法 液液萃取法
三、常用的处理Hale Waihona Puke 法-有机破坏法1.有机破坏法
特 点 样 品 1、硫酸作为分解剂（消化剂），加氧化剂 血、尿、 硝酸 — 高氯酸法 （硝酸、高氯酸、过氧化氢等）作辅助分解剂。 组织 2、破坏能力强，反应比较激烈，操作时， 电热消化器法 应在通风橱内进行。 3、先低温反应，再高温蒸发，以免发生爆 电热板消化法 炸； 人发 4、所得的无机金属离子，一般为高价态。 烘箱消化法 1、适用于卤素、硒、硫、磷等微量元素分 高温炽灼法 析的前处理 2、高温炽灼法：坩埚，先完全炭化，再灰 化，盐酸溶解定容。盐酸加无水碳酸钠或氧化 血、人 氧瓶燃烧法 镁等以助灰化。（高温电子炉、低温等离子） 发 3、氧瓶燃烧法：密闭的燃烧瓶中进行燃烧， 选择适当吸收液。 分 类
生物材料样品预处理
了解有机物和无机物的区别： • 有机化合物一般是共价化合物,以C原子为骨架连接其他元素的原子,形成的化合物如 CH3CH2OH（乙醇）；无机化合物一般没有这些特征,即使含C元素,也不是有机物，如 CO、CO2 • 无机物是无机化合物的简称，通常指不含碳元素的化合物。少数含碳的化合物，如一 氧化碳、二氧化碳、碳酸盐、氰化物等也属于无机物。无机物大致可分为氧化物、酸、 碱、盐等 • 有机物一般难溶于水，易溶于有机溶剂，熔点较低。绝大多数有机物受热容易分解、
•
常见无机物：金属、盐类
一、无机元素分析的样品预处理
*预处理目的（掌握）P9
提取、净化和浓缩被测元素或破坏样品中的有机物，释放 出被测元素，以利于后续测定（测定前排除干扰组分， 对样品进行浓缩） *选择预处理方法时满足一下基本要求（了解）P10
1、避免待测元素损失及污染 2、尽可能减少化学试剂的用量 3、操作简便，省时 4、待测组分回收率达到分析要求 5、操作过程安全性高
容易燃烧。
• 无机物与有机物在性质及反应上的差别只是相对的、有条件的，不同的有机物有其特 殊的性质。例如，乙醇、乙酸、乙醛、丙酮能与水以任意比互溶；四氯化碳、二氟二
溴甲烷等有机物不但不能燃烧，反而可以用来灭火；乙酸及其金属盐能在水溶液中电
离 • 常见有机物：醋、油、酒、糖、蛋白质 、脂质 、核酸 、汽油
(三）矿物化法（掌握）
破坏生物样品中有机物 的方法
*1、干灰化 定义：在供给能量的前 提下直接利用氧来氧 化分解样品中有机物 的方法（掌握） 步骤：干燥、炭化、灰 化、溶解灰
*2、湿消化法
定义：利用氧化性酸和 氧化剂对有机物进行 氧化，以分解破坏有 机物（掌握） 常用的氧化性酸和氧化 剂：H2SO4 HNO3 HClO4 H2O2
生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法
生物样品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法
生物样品（如血液和尿液）中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇的顶空-气相色谱检验方法可按照以下步
骤进行：
1. 样品预处理：将生物样品进行适当的前处理。
常见的前处理方法包括稀释、固相萃取或液液萃取等。
前处理的目的是去除干扰物、浓缩目标物或改变样品的特性以符合检测方法的要求。
2. 顶空采样：将预处理过的样品装入顶空采样瓶中，并用适当的方法（如注射针头或顶空装置）将顶空气相抽取到顶空瓶中。
顶空瓶中的气相是样品中挥发性化合物的浓缩形式。
3. 色谱条件设置：使用气相色谱仪，设置适当的色谱柱和色谱条件。
选择合适的色谱柱型号和尺寸，并设置适当的流速、温度梯度和检测器等参数。
常见的色谱柱选择包括毛细管柱、PTV柱或毛细管柱等。
4. 校准曲线制备：制备合适浓度范围的标准品，含有乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、异丙醇和正丁醇等目标化合物。
使用适当的浓度梯度进行稀释，并进行质量浓度的准确测定。
5. 检测分析：将顶空采样瓶插入气相色谱仪中，进行样品的分析。
通过峰的保留时间和相对峰面积与校准曲线进行比较，定量分析样品中各目标化合物的浓度。
6. 数据处理：根据样品中各目标化合物的峰面积和校准曲线，计算出其对应的浓度。
可以使用计算机软件对数据进行进一步处理和分析。
需要注意的是，该方法是一种常见的分析方法，在实际操作中可能根据不同的样品性质和实验室条件进行适当改进和调整。
在实验过程中，应遵循相关的实验安全规范，注意仪器的操作规程。
生物样本样品前处理
包括抗凝、分离血清或血浆等步骤，为血液学实验提 供合格的样本。
THANKS
感谢观看
对于光敏感的样品，在处理和 保存过程中应避免直接光照， 采用避光容器或包装材料。
添加稳定剂
根据样品的性质，可以添加适量 的稳定剂，如抗氧化剂、防腐剂 等，以保持样品的稳定性。
减少处理时间
尽量缩短样品前处理的时间，减 少样品暴露在不利环境中的机会
，从而降低样品变质的风险。
05
样品前处理中的质量控制
质量控制标准制定
稳定性和可重复性。
前处理流程简介
样本收集与保存
根据研究目的和实验设计，选择合适的生物样本（如血液、尿液、组织等），并进行适当的保存和处理，以避免样本 变质或目标分析物的损失。
样本预处理
对收集到的生物样本进行初步处理，如离心、过滤、稀释等，以去除杂质和干扰因素，为后续的分析步骤提供纯净的 样本。
目标分析物的提取与富集
03
代谢物衍生化
利用色谱、质谱等技术对代谢物 进行分离和纯化，去除干扰物质。
对于某些难以检测或不稳定的代 谢物，可以通过衍生化反应提高 其检测灵敏度和稳定性。
其他生物样本前处理技术
组织样本前处理
包括组织固定、脱水、包埋、切片等步骤，为后续组 织学观察和实验提供基础。
细胞样本前处理
包括细胞培养、传代、冻存等步骤，为细胞实验提供 充足的细胞来源。
03
样品分离与纯化
分离技术介绍
01
02
03Leabharlann 色谱分离技术利用不同物质在固定相和 流动相之间的分配系数差 异，实现样品的分离，如 液相色谱、气相色谱等。
电泳分离技术
利用物质在电场作用下的 迁移速度差异，实现样品 的分离，如凝胶电泳、毛 细管电泳等。
生物样品的采集、储存和预处理的SOP
生物样品的采集、储存和预处理的SOP1. 生物样品的采集：服药前取空白血样，服药后取样点应包括吸收相，分布相，消除相；药浓度峰值前至少有4个点，峰后取6个点或6个以上点，峰时间附近应有足够的取样点。
总取样点不少于11个，取样应持续到3 ～ 5个半衰的1/10 ～1/20。
具体可依据文献报道及预试验结果确定具体采血时期，或Cmax间点。
于服药前（0 h）和各时间点，取前臂静脉血5mL，处理后，离心10 min ( 3000r.p.m)，分离血浆或血清样品置试管中。
2. 生物样品的储存:血浆、血清样品，尽快分离（24h内），冷冻保存；短期内分析，可置4℃冰箱内冷藏。
长期分析，于－ 20℃冰箱内冷冻保存。
3. 生物样品的预处理:依据药物的理化性质，其酸碱性（pKa）、分子的亲脂性、挥发性、稳定性及可能的生物转化途径，制定相应的预处理方法。
a. 沉淀蛋白法生成不溶性沉淀:酸性试剂（三氯醋酸、高氯酸、钨酸、焦磷酸）重金属盐类（锌盐、铜盐、银盐、汞盐）盐析、脱水:硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐。
甲醇、乙腈、丙酮等可与水混溶的有机试剂。
各种沉淀试剂使用情况表b. 液-液萃取法水相pH：碱性药物最佳pH应高于其p Ka 2 ～ 3个单位酸性药物最佳pH应低于其p Ka 2 ～ 3个单位常用的有机溶剂：正己烷、异辛烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、苯、1，2-二氯乙烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯（极性由依次小至大）。
有机溶剂与水相容积比一般为 1：1或2：1。
选择提取溶剂的原则：对被测物有较大的亲和力；与水不互溶，极性较小；沸点适宜；不影响紫外检测；价廉、无毒、不易燃烧；化学性质稳定。
体内药物分析测定前生物样品的预处理及定量分析方法
宴游之乐(醉人)
心情：禽鸟乐——人之乐——乐其乐 与民同乐(醉情)
可取之处
重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学
之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，
翻译训练1．学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节
到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊
于《岳阳楼记》的千古名篇——《醉翁亭记》。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导
易
三、体内药物分析测定前生物样品的预处理
样品种类 常用的样品的种类包括血样,唾液和尿液 血样是指全血、血浆或血清,一般情况下血浆分 离快、易得,故最常用 唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔黏膜内 腺体分泌的 尿药浓度测定主要用于剂量回收、药物代谢和 生物利用度等研究 脏器组织，除非特别需要，在临床治疗药物监 测中很少使用
1．在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2．反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，
形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形
生物样品预处理的方法
生物样品预处理的方法一、生物样品预处理的重要性。
1.1 生物样品的复杂性。
生物样品那可是相当复杂的呀。
就拿血液来说吧，里面有各种各样的成分，像血细胞、血浆蛋白、各种离子、代谢产物等等。
这些成分混在一起就像一锅大杂烩，如果不进行预处理，想要准确分析其中特定的物质，那简直就是大海捞针，难上加难。
1.2 提高分析准确性。
预处理就像是给我们的分析工作打基础。
如果不把那些干扰的成分去除或者分离，分析仪器可能就会被误导。
比如说在检测血液中的某种药物成分时，如果血浆蛋白没有处理好，蛋白可能会包裹药物，导致检测到的药物含量比实际的少很多，这就会得出错误的结论。
所以预处理是让我们的分析结果更靠谱的关键一步。
二、常见的生物样品预处理方法。
2.1 蛋白质沉淀法。
这是一种比较简单粗暴但很有效的方法。
就像把混在沙子里的石子挑出来一样，我们通过加入一些试剂，像有机溶剂（如甲醇、乙腈）或者酸，让蛋白质沉淀下来。
这就好比给蛋白质使了个“定身术”，让它们从溶液里分离出来。
这样一来，那些被蛋白质包裹或者干扰的目标物质就能够更好地被检测到。
不过这种方法也有缺点，有时候会把一些小分子的目标物质也一起沉淀了，就像打扫卫生的时候不小心把有用的小物件也扫走了一样。
2.2 液液萃取法。
这就有点像油和水分离的感觉。
我们利用目标物质在两种互不相溶的溶剂中的溶解度差异，把目标物质从生物样品所在的溶剂中转移到另一种溶剂里。
比如说，我们要从血液的水溶液中提取一种脂溶性的药物，就可以加入一种有机溶剂，像氯仿，药物就会跑到氯仿层里，就像孩子找妈妈一样，然后我们把氯仿层分离出来，就得到了相对纯净的含有目标药物的溶液。
但是这个方法操作起来有点麻烦，就像走迷宫一样，要小心翼翼地确保每一步都准确。
2.3 固相萃取法。
这个方法可以说是比较高端大气上档次的。
我们把一种特殊的吸附剂装在一个小柱子里，然后让生物样品溶液通过这个柱子。
目标物质就像被磁石吸引一样，吸附在柱子里的吸附剂上，而那些杂质就流走了。
生物样品预处理的原理
生物样品预处理的原理生物样品预处理涉及到对生物样品中的杂质、干扰物以及与实验目的无关的成分进行去除和处理，以保证实验结果的准确性和可靠性。
生物样品预处理的主要原理包括样品的选择与采集、样品的保存与保护、样品的前处理步骤等。
首先，生物样品的选择与采集是生物样品预处理的第一步。
根据实验的需要和目的，选择合适的生物样品进行采集。
生物样品的选择要基于样品的来源、适应实验的要求以及研究的目标等因素进行综合考虑。
例如，对于研究人类血液中特定物质的含量，可以选择采集血液样本作为研究对象。
样品采集的方法和技术也应根据实验的要求选择，包括无菌采集、活体采集、组织切割或取样等。
其次，样品的保存与保护是生物样品预处理的重要步骤。
样品的保存和保护可以避免样品在采集后发生腐败、分解、变质等现象，确保样品的完整性和稳定性。
常见的样品保存方法包括低温保存、冷冻保存、真空保存、避光保存等。
对于涉及酶、蛋白质和核酸等生物分子的实验，常采用低温冰箱或液氮保存样品，以避免生物分子的降解和失活。
第三，样品的前处理步骤是生物样品预处理的关键环节之一。
在实验分析之前，通常需要对样品进行一系列的处理步骤，以去除杂质、净化样品或改变样品的性质，以满足后续实验的需求。
常见的前处理步骤包括离心沉淀、超滤、脱色、溶解、稀释等。
离心沉淀可以去除悬浮物、沉淀物和大分子物质，使样品更纯净。
超滤可以去除大分子，提取溶液中的小分子成分。
脱色可以去除样品中的色素、杂质和自动发生的化学反应产物。
溶解可以将样品溶解到适当的溶液中，以满足后续实验的需要。
稀释可以调整样品的浓度和组分比例，以便于后续分析或实验。
此外，为保证样品预处理的准确性和可靠性，还需要注意以下几点。
一是实施严格的质量控制措施，包括使用消毒剂消毒实验室设备、无菌操作、采用纯净试剂和纯水等。
二是避免样品污染与交叉污染。
样品之间、样品与外界以及样品与实验人员之间的交叉污染会导致实验结果的干扰和扭曲。
因此，要严格控制实验环境的洁净度、操作人员的卫生习惯和实验区域的通风等。
生物样品的预处理
2.2.1 植物组织中活性物质的提取
植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取生物大分 子的过程变得复杂。
植物组织被破坏时，蛋白质等大分子和酚类处混合接触 状态，很易发生反应。酚类氧化产物醌类和单宁酸类会 继续和蛋白质反应, 使目的蛋白失去活性。为此去除酚 类化合物或避免反应是必须进行的步骤。
在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时，其他大分子的 存在会对提取产生干扰，需要有效手段去除。
通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内,如胶体 的颗粒表面吸附大量的高分子物质,反而会在表面形 成空间保护层。
絮凝剂分类
无机絮凝剂 无无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合铝铁等)
有机絮凝剂 天然高分子絮凝剂(如淀粉的改性产物) 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺)
2.2.3.1 微生物发酵液预处理
主要包括 （1）发酵液杂质的去除 （2）改善发酵液的处理性能
（1）发酵液杂质的去除
发酵液成分复杂，对提取影响较大的是高价无机离子、 杂蛋白和色素物质，影响后期离子交换、萃取、膜过滤、 测定等……
无机离子的去除 钙离子：加入草酸形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还 能促使蛋白质凝固 镁离子：加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物， 可不再干扰离子交换 铁离子：加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀
3. 常减压蒸馏装置的火灾危险性
常减压蒸馏装置是原油加工的第一道工序,是石化企业的“龙头”装置, 它为后续的装置提供原料,在石化企业中占有举足轻重的位置。该装置主要 包括电脱盐、常压蒸馏、减压蒸馏。其工艺原理是利用原油中各组分沸点的 不同,
通过加热,使其全部或部分汽化,反复地通过冷凝与汽化,将各种烃类混合 物进行分离。
① 当通风良好时,应降低爆炸危险区域等级(爆炸危险区域内的通风,其空气 流量能使易燃物质很快稀释到爆炸下限值的25%以下时,可定为通风良好);当通 风不良时应提高爆炸危险区域等级。
生物样品预处理
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-参加与水相混溶的有机溶剂
操作步骤：
a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例 混合
b.离心别离，采用超速离心机〔10000r／
min〕离
将蛋白质粘牢在
管底，便于吸取
心1～2min。〔使用具塞上塑清液料尖底管〕
c.取上清液作为样品。
三、常用的处理方法-除蛋白法
111
0.87 沸点过高，调节极性用
55
0.74 含过氧化物
68
0.73 含过氧化物
35
0.71 含过氧化物
61
1.5 肝脏毒性，致癌作用
83
1.26
116
0.8
沸点过高，调节极性用
77
0.9
118
0.81 沸点过高，调节极性用
83
0.79
四、别离、浓集、纯化-液液萃取法
影响萃取的因素
2.有机溶剂相和水相的体积 a.有机相与水相〔体液样品〕容积比为1:1或
三、常用的处理方法-缀合物的水解
特点：多用于尿中药物或其代谢物；缀合物极性 较大，不易被有机溶剂提取。
常用方法：
a.酸水解：适量盐酸〔条件因药而异〕
b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者 的混合酶，一般控制pH值在～， 37℃培育数小时。
三、常用的处理方法-缀合物的水解
b.酶水解法
温和
专属性强
性盐 蛋白质沉淀
强酸
溶剂解 参加中
参加
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-参加与水相混溶的有机溶剂 参加水溶性的有机溶剂，可使蛋白质分子内 及分子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋 白质结 合的药物释放出来。 常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙 醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血 清与水 溶性有机溶剂的体积比为1：〔1～3〕时， 就可以将
生物实验样品预处理
样品预处理4.1.5.1准备工作若必要时将冷冻样在冰箱（-2-4C）中放置过夜，使部分解冻以便切片。
用合成洗涤剂清洗塑料刀、碟、镊子、塑料板及尺和称重塑料膜，用蒸馏水或清洁海水漂洗干净。
工作台用洗净的塑料膜罩上。
用合成洗涤剂(4.1.2-2)仔细地洗手，后用蒸馏水或漂洗干净。
PF一胸鳍；DF一脊鳍，虚线表示刀切位置图3鱼体简图中小型鱼样制备4.1.5.4.1单个体样品：测量鱼的叉长，并于聚乙烯称样膜上称重。
记下叉长和体重。
用蒸馏水或清洁表层海水（4.1.2.1)洗涤鱼样，将它放在工作台上，用塑料刀切除胸鳍并切开背鳍附近自头至尾部的鱼皮（图3),在鳃附近和尾部，横过鱼体各切一刀；在腹部，鳃和尾部两侧各切一刀。
四刀只切在鱼体一侧，且不得切太深，以免切开内脏，沾污肉片。
最好在切片时，由另一人帮助按住鱼的头尾。
用镊子将鱼皮与肉片分离，谨防外表皮沾污肉片。
用另一把塑料刀将肌肉与脊椎分离，并用镊子取下肌肉。
将组织盛于塑料容器中，称重并记录重量。
若一侧的肌肉量不能满足分析用量，取另一侧肌肉补充。
盖紧容器，贴上标签或记号，记录各所有数据，于低温冰箱中保存。
鉴定性腺性别。
4.1.5.4.2多个体试样：制备方法如下。
仔细记下各个体体长、鲜重、肌肉重。
鉴定性别。
个体数不应少于6个，且性别应相同，大小相近。
用匀浆器匀化鱼组织，将匀浆转入已知重量的塑料容器中，盖紧，贴上标签并称重，记下匀浆重和其他数据。
置于低温冰箱中存放。
干样制备将部分新鲜试样按4.1.6.1或4.1.6.2步骤烘干，计算干／湿比，以校正水分含量。
干燥后的样品用玛脑研钵磨碎，全部筛过80-100目（尼龙筛），供痕量元素分析用。
4.1．6干重测定41.6.1烘干半开称量瓶的磨口盖，放入105℃烘箱中。
2h后，取出称量瓶，置于干燥器中冷却30min. 盖好瓶盖，用分析天平称重，记下重量。
取5^10g生物制备样（4.1.5)于称量瓶中，盖好瓶盖，再称重（士0.5mg）并记下重量。
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二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
D.药物的稳定性： a.易氧化药物:加入抗氧剂 b.易被光分解药物:避光 c.易被酯酶水解药物:对酶进行灭活
二、指导原则-预处理应考虑问题
2.待测药物的浓度 浓度越大，预处理要求越低；反之，浓度越小， 预处理要求越高。例如，地高辛的治疗血药浓度 为1-2ng/ml,而水杨酸的治疗血药浓度为20100μg/ml。
生物样品预处理的常用方法 以及最新进展
目录
1
2 3
生物样品预处理的目的
预处理的指导原则
常用的处理方法
处理方法简介
4
一、生物样品 生物样品的种类
血液
组织 器官 生物 样品 唾液 头发
• • •
三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需 用酶解法。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。 它不仅可使组织溶解，并可使药物析出。枯草菌溶素是 一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH范围（ PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃ 具有最大活力。
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
操作步骤： a.水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合 b.离心分离，采用超速离心机（10000r／min）离 心1～2min。（使用具塞塑料尖底管） c.取上清液作为样品。 将蛋白质粘牢在
三、常用的处理方法-除蛋白法
B.加入中性盐
加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐 能将与蛋白质水合的水臵换出来，从而使蛋白质脱 水而沉淀。 常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷 酸盐及枸橼酸盐等。 操作：a.按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2混合; b.离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以 上的蛋白质。 c.得上清液的pH为7.0～7.7。
坏 表面水化层 蛋白质亲水胶体颗粒 表面电荷 破 坏
调节pH至等电点 凝集析出 加入脱水剂
三、常用的处理方法-除蛋白法
测定血样时，首先应去除蛋白质。 去除蛋白质作用：
a.可使结合型药物释放出来，以便 测定药物的总浓度； b.可预防提取过程中蛋白质发泡， 减少乳化的形成； c.可保护仪器性能（如保护 HPLC柱 不被污染），延长使用期限。
管底，便于吸取 上清液
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂 只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 3）在生化制备中应用比盐析法广泛。
缺点：对具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和 酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。
二、生物样品预处理的指导原则
生物样品进行预处理时应考虑到的问题：
1.药物的理化性质和存在性质
2.待测药物的浓度
3.药物测定的目的 4.选用的生物样品类型 5.样品预处理与分析技术的关系
二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式 三、常用的处理方法-除蛋白法
2.酶解法
操作：先将被测组织加Tris-缓冲液pH 10.5及酶， 60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液， 即可供药物提取用。 优点：可避免某些药物在酸及高温下降解；对与 蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英钠）， 可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取 酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检 测时，无需再进行过多的净化操作。
不足：不适用于在碱性下易水解的药物。
三、常用的处理方法-缀合物的水解
• 缀合物：药物或其代谢物与内源性物质结合生成 的产物。
•
内源性物质： a.葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸 等； b.一些含有羟基，羧基，氨基和巯基的药物，可 与内源性物质葡萄糖醛酸结合形成葡萄糖醛酸 苷缀合物； c.一些含酚羟基，芳胺及醇类药物与内源性物质 硫酸形成硫酸酯缀合物。
三、常用的处理方法-除蛋白法
D.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂
• 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质 分子中带负电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。 常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等。 离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。 优点： 可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处 理后进样，简化操作。
二、指导原则-预处理应考虑问题
1.药物的理化性质和存在形式
B.药物在体内的存在形式及蛋白结合率：
a.结合蛋白率高: 首先去蛋白 b.多为代谢缀合物：缀合物水解 C.药物的光谱特性及官能团特性：涉及分析仪器 的选择以及是否需要衍生化和特殊检测器。 紫外吸收强弱：是否用UV检测器 含有-NO2 、-Cl等电负性基团：ECD检测器
三、常用的处理方法-缀合物的水解
b.酶水解法
温和 专属性强
费用高
特点
时间长
带入粘蛋白导致乳化
带入粘蛋白阻塞色谱柱
四、常用的处理方法-分离、浓集、纯化
（一）液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE） 是传统的分离、分析方法，据检测灵敏度要求，提取后 一般需浓集。 传统浓集方法： a.在末次提取时加入的提取液尽量少，使被测组分提取 到小体积溶剂中，然后直接吸出适量供测定。 b.挥去提取溶剂法。挥去溶剂时应避免直接加热，防止 被测组分破坏或挥发损失。挥去提取溶剂的常用方法 是直接通入氮气流吹干；对于易随气流挥发或遇热不 稳定的药物，可采用减压法挥去溶剂。
三、常用的处理方法-缀合物的水解
特点：多用于尿中药物或其代谢物；缀合物极性 较大，不易被有机溶剂提取。
常用方法：
a.酸水解：适量盐酸（条件因药而异） b.酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或两者 的混合酶，一般控制pH值在4.5～5.5， 37℃培育数小时。
尿液
其他
胆汁、乳汁、脑脊液、泪液、 精液、胃液、胰液、淋巴液、 粪便等。
一、生物样品预处理的目的
1.使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的 总浓度。
2.生物样品介质组成复杂，干扰多，而药物组分是微量 的，必须先经过预处理，使纯化，富集。
3.为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度。 4.为了防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度、 准确度、精密度和选择性等。
三、常用的处理方法-除蛋白法
1.蛋白质沉淀方法
溶剂解法 盐析和脱水 加入中性盐 蛋白质沉淀
加入强酸
生成不溶性盐沉淀 加入重金属沉淀剂
三、常用的处理方法-除蛋白法
A.溶剂解法-加入与水相混溶的有机溶剂
加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子 间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结 合的药物释放出来。 常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙 醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水 溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将 90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不 同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液 的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH 为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。
湿法 破坏
干法 破坏
三、常用的处理方法-除蛋白法
蛋白质 沉淀
酶解法
去除蛋白
三、常用的处理方法-除蛋白法
1.蛋白质沉淀
蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为 蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质 一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质 沉淀，在一定的条件下，变性的蛋白质也可 不发生沉淀。 破
分析：过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；
也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳 酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯 酸钾（钠）沉淀而被除去。偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去。 因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性条件下易 分解的药物不宜用本法除蛋白。
四、分离、浓集、纯化-液液萃取法
原理：
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度 大于在水相中的溶解度，而血液或尿液中含有的大多 数内源性杂质是强极性的水溶性杂质。因而用有机溶 剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提 取药物经浓集后作为分析样品。
C.加入强酸
当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式 存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶 性盐而沉淀。 常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸钨酸混合液及5％偏磷酸等。
三、常用的处理方法-除蛋白法
C.加入强酸
操作：
a.含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合; b.离心〈10000r／min）1～2min(可以除去90％以上的蛋白质) c.取上清液作为样品。 优点：该方法去蛋白迅速简单， 且而所需样品量少， 组分极少变化。
A.酸碱性质、未电离分子的亲脂性、挥发性：涉及药物 的提取性质、是否挥发损失以及能否采用GC法 a.较亲脂的药物：可用溶剂萃取，也可用烷基键和相 硅胶、大孔吸附树脂及亲水型填料SPE等方法。 b.亲水性较强且有酸碱性、可电离药物：离子交换柱 和离子对液液萃取等。 c.亲水性较强但不能电离药物：沉淀蛋白
三、常用的处理方法-除蛋白法
B.加入中性盐
• • •
• • •
优点: 药物的回收率高； 不引起蛋白质变性。
注意事项 : 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度， 溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。
三、常用的处理方法-除蛋白法
三、常用的处理方法
常用方法