显微镜技术基本原理

N与D成反比 ，λ与D成正比
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提高显微镜分辨率的方法
（1）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，
如香柏油n =1.52,不仅使n 增大，而且孔径 角也增大。
（2）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。
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(四) 视 野
视野(visual field)又称视场 (field)，是指通过显微镜所能看到 标本所在空间的范围。
透镜的色差
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透镜的轴向色差（Ａ）和垂轴色差（Ｂ）
Ａ B
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五、光学显微镜的不足之处
1、放大倍数的极限： 2000
2、分辨率的极限： 0.2m （可见光照明）
3、景深的极限： 0.1m （要求金相准备）
4、不能分析化学成分
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第二节 光学显微镜的分类及其应用
(二) 数 值 孔 径
NA=nsinβ
低数值孔径 干物镜
较高数值孔径 干物镜
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油
油
最高数值孔径 油浸物镜
(三) 分 辨 率
• 分辨率：显微镜的最重要参数，能够区 分开两个质点的最小距离。
0.61λ D= N•sinα/2
D：分 辨 率 λ ：光波的波长 N：介质折射率 α ：物镜镜口角
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光学显微镜的工作原理图
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二、光学显微镜的基本结构
① 机械部分：镜座、 镜柱、镜臂、镜筒、调焦装 置、载物台（物镜转换器）
② 光学部分：目镜、 物镜、反光镜、聚光镜 放大倍数：
目镜的放大倍数×物镜的 放大倍数
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三、光学显微镜的性能参数
(一) 放大率 (二)数值孔径 (三)分辨率 (四)视野 (五) 景深与焦长 (六)镜像亮度和清晰度 (七)工作距离
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七、偏 光 显 微 镜
偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折 射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光) 的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪 器。
利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶 原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或 液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维 等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过 程。
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荧光显微镜的种类
A 透射式
B 落射式
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荧光显微镜的主要部件
透射式 • 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
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落射式 • 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
如果离光轴越远处放大率越大，则像 的外部线段将比中间线段长，结果形成了枕 形畸变，这种畸变称为正畸变。
反之则形成边缘放大率小而近轴放大 率大的桶形畸变，称为负畸变 。
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透镜的畸变
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(二)、 色 差
色差(chromatic aberration )是一种由白光或 复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程 差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的 不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。
(二)、色差
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(一)、像 差 (aberration)
像wenku.baidu.com是指透镜所成的像与理想像 在形状、颜色等方面存在差异。
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1．球 差 ( spheric aberration )
光轴上的点光源所发出的光 锥入射到透镜的球折射面时，由 于通过透镜边缘的光线不满足近 轴光线的条件，因此不能和通过 近轴曲面的光线会聚成一个理想 的亮点，而是形成一个中间亮边 缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透 镜的球面像差，简称为球差。
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暗 视 野 照 明 方 式
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六、紫 外 光 显 微 镜
使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨 率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独 特的效果。生物细胞中的原生质对可见光几 乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分 子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可 以使用紫外光显微镜（ultraviolet microscope）研究单个细胞的组成与变化情 况。
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相衬显微镜照明原理
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三、相 衬 显 微 镜
光通过标本致密区时发生衍射，产生 偏折光，相位和未受影响的直射光相比被 推迟了1/4λ。只有未发生偏折的的直射光 可通过相位板的环形区，其它的偏折光在 物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板 的环形区的光不同的1/4λ的光程差。两组 光在平面上成像。
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(二) 数 值 孔 径
数值孔径(numerical aperture)又叫镜 口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物 镜孔径角的一半(β)正弦值的乘积，通常缩 写为NA，即
NA=nsinβ 显微镜的数值孔径与其放大率成正比， 与分辨率、景深成反比，它的平方与图像 亮度成正比。
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第一节 光 学 显 微 镜
一、光学显微镜的工作原理 二、光学显微镜的基本结构 三、光学显微镜的性能参数 四、像差和色差 五、光学显微镜的不足之处
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一、光学显微镜的工作原理
显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把 焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜 （ocular lens）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第 一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级 放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距 离处。
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一、双 目 生 物 显 微 镜
目镜
物镜 聚光器 光源
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二、荧 光 显 微 镜
荧光显微镜 (fluorescence microscopy)是以 紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产 生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利 用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。
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四、倒 置 显 微 镜
倒置显微镜(Inverted Microscope)的 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照 明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培养的活细胞，具 有相差物镜。
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倒 置 显 微 镜
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五、暗 场 显 微 镜
暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有档光片，使 照明光线不直接进入物镜，只允许被标本 反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的 背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这 种显微镜能见到小至 4nm~200nm的微粒 子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
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三、相 衬 显 微 镜
如相板的环形区使直射光超前1/4λ，加上开始 直射光超前的1/4λ，直射光共超前1/2 λ，直射光和 偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。
如相板的环形区使直射光滞后1/4λ，加上开始 直射光超前的1/4λ，两者相抵直射光不发生变化， 直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增 加，产生明反差。
镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬 度适中的程度。
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(七) 工 作 距 离
工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本 间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成 反比。
一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距 离赿小。
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四、像 差 和 色 差
(一)、像差 1．球差( spheric aberration ) 2．彗差(broom aberration) 3．像散(astigmatism) 4．场曲 5．畸变(distortion)
活细胞和未染色的标本由于光的波长 和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相 位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应 把透过标本不同区域的光波光程差转变成 振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰 可见的明暗对比。
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三、相 衬 显 微 镜
相衬显微镜比普通光学显微镜多了2个 部件：
在聚光器上增加一个环形光阑； 在物镜后焦面增加一个相板，相板上 有一个环形区，通过环形区的光比从其它 区域透过的光超前或滞后1/4λ，这样就使 通过标本不同区域光波的相位差转变为振 幅差。
显微镜技术和显微镜
教学基本要求
掌握常 用显微 镜的结 构及性 能特点
熟悉显微 技术的基 础理论， 显微镜的 应用
了解显微 镜的维护， 显微技术 的进展
内容提要
第一节 光学显微镜 第二节 光学显微镜的分类及其应用 第三节 电子显微镜 第四节 显微镜的维护、常见故障及排除 第五节 显微摄影术
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(一) 放 大 率
显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是 指显微镜经多次成像后最终所成(放大的)像的大小相 对于原物体大小的比值，常记作M。
M=maq
M是显微镜的总放大倍数；m是物镜的放大倍数；a是目镜的放大 倍率，一般表达为明视距离(正常视力者为25cm)与目镜焦距之比；q为 在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为1.6倍。
为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。
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二、荧 光 显 微 镜
荧光（Fluorescence）： 细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照
射后能发出可见光线，称为荧光。 自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线
照射后发出的荧光。 诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射
后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、 吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片 染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱 发荧光。
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透镜的彗差
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光轴
透镜
3．像 散 (astigmatism)
远离光轴的物点发出的光，即使是以 细光束成像也不可能会聚于一点，而是在 像空间不同的成像面上或者成椭圆弥散斑， 或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是 形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像 缺陷称为像散。
一般来说，透镜像散随透镜形状、光 阑位置而异，可以用正、负透镜适当组合 而消除。
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落射荧光显微镜的构造
紫外线保护罩
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS）
视场光栏（AS）
分色镜
汞灯
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透射荧光显微镜原理
物镜
目镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯 激发滤色镜
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落射荧光显微镜原理
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三、相 衬 显 微 镜
光线只有通过染色标本时其波长、振 幅发生变化，人眼才能看见。
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透镜的像散
物镜
垂直 焦平面
水平 焦平面
光轴
明晰圆
物点
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4．场 曲
一个平面的物体通过透镜成像后，虽 然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所 成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的 面，这就是场曲。
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5．畸 变 (distortion)
由于像平面上各处放大率不同引起的 成像缺陷称为畸变 。畸变的原因是由于透 镜边缘与透镜近轴的放大率不同而引起的。
一、双目生物显微镜 二、荧光显微镜 三、相衬显微镜 四、倒置显微镜 五、暗场显微镜 六、紫外光显微镜 七、偏光显微镜 八、激光扫描共聚焦显微镜 九、干涉相衬显微镜 十、近场扫描光学显微镜
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一、双 目 生 物 显 微 镜
双目显微镜(binocular microscope)的结构是 利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相 同的两束而形成两个中间像，分别再由左右目镜放 大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束， 进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光 程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本 要求。
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(五) 景 深 与 焦 长
景深(depth of field)又称焦点深度， 是指在成一幅清晰像的前提下，像平面 不变，景物沿光轴前后移动的距离称 “景深”。
景物不动，像平面沿光轴前后移动 的距离称“焦长”。
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(六) 镜 像 亮 度 和 清 晰 度
镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。 高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显 微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜 的性能参数相关。
球差可以通过设置光阑而减 小。
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透镜的球差
2．彗 差 (broom aberration)
近光轴外的点光源发出的光束，经过透 镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一成 像平面上也不能交于同一个像点。离光轴越 近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。于 是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，远 离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模糊 尾部，形如彗星，称为彗差。