普通PCR设计引物应遵循以下原则
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
一设计引物应遵循以下原则
1 、引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
2 、引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3 、引物碱基:G C含量以40-60%为宜,G C太少扩增效果不佳,G C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm 值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃,设计时温度和GC含量是个主要的参数,做复合扩增时更要设计成相近的温度,而且引物加个尾影响不大。
但要切记BLAST,包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
4 、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5 、引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6 、引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
引物5‘端引入酶切位点得黏性末端,随意加入3个保护性碱基,但是要注意不要形成引物二聚体,而且以A或G开头为好。
7 、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
8 、引物酶切:除非产物非常特异,直接酶切PCR产物效果有时不是很好,还有一般PCR 体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。
酶切后,可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物,获得高纯度得酶切产物,也即是你的黏性目断片断供后边得试验。
9 、设计软件:最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
二引物保存
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。
TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。
三各种PCR的引物设计
1、长距离PCR:
标准PCR的扩增长度在1~2kb间,不能满足中大型基因的扩增。
在此背景下产生了长距
离PCR。
其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:
a 、长度一般在25~30bp间;b、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。
如果两条引物的解链温度的差异大于1度,就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。
2、反相PCR:
标准PCR应用于已知片断的扩增。
而反相PCR应用于扩增已知片断相邻的未知片断,主要应用于a,产生探针;b,从总RNA中克隆未知cDNA序列;c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列。
其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外,其它同标准原则。
3、差异显示PCR(DD-PCR):
次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA,通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。
其引物有两套,一为锚定引物,一为随机引物。
锚定引物是由12个不同引物组成的库,序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任一个,Y可以是ATGC中的任一个。
随机引物是由15个不同的,长度为10mer的引物组成。
它们的序列都是随机形成的,都应改包含几乎相等的四种单核苷酸,G与C 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结构的倾向。
4、多重PCR:
多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断,以节省模板、节约时间和减少费用。
引物设计在遵守标准PCR引物设计的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度,引物之间不会发生相互作用,扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。
5、热启动PCR
6、降落PCR
这两种PCR只是为了满足特别要求,在标准PCR的基础上进行了一些方法上的改进,而对引物没有什么特殊的要求,按照标准PCR的引物设计原则即可。