尿蛋白电泳操作规程

尿蛋白电泳操作规程

一．项目名称

尿蛋白电泳（HYＤRAＧEL PROTEINURIＥ)

二．检验方法名称

SDS-琼脂糖凝胶区带电泳

三．方法学原理

在含有多量的阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SＤS）液体中,蛋白质可与其连接，形成ＳＤS—蛋白质复合物。这种复合物蛋白本身的构造已经破坏，他们都表现出相同的构造和相同的负电荷。当这种SDS—蛋白质复合物在具有适当筛选功能的介质中电泳时，如在含高浓度琼脂糖的HYDＲＡGEL 5 PROTEＩNURIE凝胶上电泳时,蛋白质按它们的分子量大小进行分离。

在HYＤRAＧEL 5 PRＯTEＩＮＵRIＥ凝胶上能清楚分离来源于肾小管(分子量＜65-7０Kｄa)还是来源于肾小球(分子量>65-70ＫDａ)的蛋白质，因此尿蛋白不仅能被检测到,而且能对蛋白来源进行分类(肾小球,肾小管性和混合性)。

四．方法学溯源

自１９3０年由Tiselius发现了移界电泳（moｖinｇ bouｎdarｙeectroｐｈoresiｓ),而后,这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zoｎｅeｌｅｃrrｏpｈoresｉs)所克服,区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。

五．仪器

（一）型号:SＥＢIＡ HＹDRASＹS (PN1210)

（二）分析和计算参数：

1．处理量:约1４个样本／小时

2．所需样本量：5uｌ

3．检验时间:约5０分钟

4．重复性:有良好的批内和批间重复性

5．电泳参数：电压０-300Ｖ(可选至3００0V)

电流0－５０0mＡ

功率0-100Ｗ

六．试剂及配套品

（一）试剂

1．ＨＹDRAGEL ５ PＲOTEＩNURIE试剂盒

（1）商标:SEBIＡ

（2）包装规格:50测试

（3）货号:PN４115

2．脱色液

（1) 商标：SEBIA

(２) 包装规格:Ｐａck foｒ 1０×１０0ｍl

（3) 货号：PＮ4５40

（４) 成分:柠檬酸

３．洗涤液

（1）商标：ＳEＢＩＡ

（2）包装规格：Ｐａｃk foｒ 1０×8０ml

（3）货号：PN4５41

（4）成分：叠氮钠

（二）配套品

尿蛋白质控

(1）商标：ＳＥBIA

(2）包装规格:Pａck foｒ 5×1ml

（３）货号:PＮ4７81

七．操作步骤

㈠开机,启动电泳仪。

㈡打开密闭的凝胶片盒，取出凝胶片并放在关闭的凝胶片盒上,用滤纸条轻柔、迅速地吸去凝胶片槽孔中的多余水分,在每一槽孔内加入5ｕｌ已处理的尿样本，注意不能有气泡，在每次加样前应擦拭移液器尖端，在整个加样过程千万不可触及槽孔的底部。

㈢选择«ＰROTEIＮURＩＡ 1*5 »程序进行一个凝胶片的电泳,或者«PＲOＴEINURI Ａ 2*5 »程序进行两个凝胶片的电泳。

㈣取出缓冲条固定在电极架上,当放一个凝胶片时将１20ul蒸馏水或去离子水加在电泳舱的温控板上偏下中间处，或者在放两个凝胶片时，在偏下的左半侧和右半侧各加１00ul 的蒸馏水或去离子水;将凝胶片底边紧靠框架底边,边缘对齐边线，略弯曲凝胶片慢慢放平,注意凝胶片下面勿出现气泡。

㈤自然放下支架，关上电泳舱盖,按下键盘左侧的绿色箭头“ＳTＡRT”键，电泳开始,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。

㈥电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束，打开电泳盖,将加样梳和缓冲条丢弃，取出已烘干的胶片，用湿纸巾擦拭电极和温控板,将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中,在检查染色液瓶内是否有300ml染色液,脱色液瓶内是否有１00０ｍｌ脱色液,保存液容器内是否有300ｍl保存液以及是否排空了废液瓶后,选择«Proteｉnuｒia»染色程序并按“start”键开始染色。

㈦在染色、脱色以及干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架并取下已干燥的凝胶片,可用湿软的纸擦干凝胶片背面的塑料支持膜。

㈧关机。

八．参考范围

本试验是定性结果。

九．临床意义

㈠生理性蛋白尿：尿蛋白含量是很低的,通常低于120ｍg/２4ｈ，男女之间无明显差异。主要是白蛋白，有时可有极微量的转铁蛋白或免疫球蛋白，当尿蛋白>120mｇ／24h时,应考虑为病理性蛋白。对阳性的尿蛋白（＞120ｍg/24h)应注意随访。

㈡肾小球型蛋白尿:尿蛋白其特征为:分子量＞６５-7０KDa(如白蛋白、转铁蛋白和IgG),电泳条带显示位置在样本加样点与白蛋白部分之间，白蛋白是其主要组分。

㈢肾小管型蛋白尿：其蛋白特征为：分子量＜6５-70KＤa,电泳条带位于白蛋白和凝胶片阳极端之间。如α1－微球蛋白,游离轻链单体，β2－微球蛋白，视黄醇结合蛋白(RBP)，溶菌酶,单纯性肾小管型蛋白尿中白蛋白只占少部分。

㈣混合型蛋白尿:其蛋白特征为肾小管及肾小球的蛋白同时并存。

通过此方法我们可以很容易地对肾脏疾病作早期诊断/鉴别诊断及分型、治疗效果的观察、肾活检(属创伤性诊断)前的筛查、甚至代替肾活检。

十．标本要求

㈠取2４小时的新鲜尿液,必要时样品在2℃～８℃可保存一周。冷冻的样本可保存一个月。冷冻样品中加入HEPES 0.１ M （pH 6.7５)和叠氮钠０．0２g/dｌ，则可提高保存的稳定性。勿用硼酸做为防腐剂。解冻后样本可产生蛋白变性导致的细小点样痕迹。

㈡取20ul稀释液（这种液体很粘稠,吸管取时要保持垂直，慢慢吸,保证无气泡),放入小试管底部,保证粘稠液体不粘在管壁上,加８0ul纯尿液，旋涡混匀5秒钟。

如果尿蛋白>０.2ｇ/dl，则尿液先用盐水稀释至０．2g／ｄl左右，然后再按下列标准程序操作。

注意:混浊的尿样本（未稀释的或浓缩的）点样后很难渗透到点样器的末端，建议使用离心法（例如：3000转数/分,１0分钟)或者过滤法（例如：0.４5ｕm孔径滤过器）来除去杂质微粒。

十一. 操作注意事项

㈠为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的所有组分必须一并使用。

㈡用滤纸吸去凝胶表面多余液体时,接触时间不能太长，应快速移去，以免凝胶脱水。

㈢注意先挂缓冲条再放凝胶片,缓冲条取出时应均匀挤捏使缓冲液能分布均匀。