降低蜂毒素溶血作用的研究进展

北方药学 ２ １ ０ ２年第 ９卷第 ５ 期
其 从 实验 走 向 临床 最关 键 的步 骤 之一 。 目前 国 内外 针对 ｎ８ ｒ ｈ Ｌ Ｔｉ Ｂ，Ｐ ｕ Ｎ，Ｓ ｉ ａｈＪ Ｅ ｅｔ ｆ ｅｈｎｌ ｅｄｎ ］ ｎ ｈ ｅＪ ｈｌ ｃ ． ｆ ｃ ｏ ｔａｏ ｆｅｉｇ ｏ ｍ ｏ Ｍｅ ｔｎ构效 关 系 的研 究 主要 集 中在 抗 微 生 物 特 性 方 面 ， ｓｒ ｔｇｅ ｎ ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ａ ｄ ｙｅｄ ｏ ｅ ｏ ｉ ａ ｔ ｍｏ ｓ ｎ ｏ ｌｔ ｉｉ ｔａｅ ｉｓ ｏ ｒ ｄ ｃｉ ｎ ｉｌ ｆ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｕ ｅ ｅ ｄ — Ｍｅ ｔｎ的结构变 化 ， 其溶 血作 用 和抗微 生 物作 用 的影 响 ｓ ｔ ｏ ｉ ｉ ｐ ｓ ｒ ［． ｉ ｅｈｏ ｉ ｎ ，０ ３ ２ ４ ： ｌｔ ｉｉ 对 ｔ ｉ ｆ ｍ Ｐｃ ａ ａｔ ｓ Ｊ Ｂｏ ｃｎｌ ｏ ｇ２ ０ ，８ （ ） ａ ｎｒ ｈ ｏ ｉ ］ ｔ Ｂ ｅ 是 相对独立 的 ＂。 ］那么 ， ｅｉｉ Ｍ ｌｔ ｔｎ抗肿瘤 作用 和溶 血作 用与 ４３ －４ ４． ８ ４ 其 分子结构 的关 联是否 也存 在差异 ？ 能否通 过对 Ｍ ｌｔ ｅｉｉ ｔｎ分 『 ］ １ 赵亚华 ， ９ 刘霭珊 ， 日清 ， 蜂毒溶血肽作 用机理研究进展 李 等． 子 结构 的改造使 抗肿瘤 作用 和溶 血作用 这两种 生物 活性得 『． 虫学报 ，０ ７ ５ （ ） ３— ４ ． Ｊ昆 ］ ２ ０ ，０ ７ ： ７ ７ ４ ７ 到分 离 ？对 于这 样一 个 存在 巨 大潜 在 临床价 值 的药 物 ， 找 ｆ０Ｓｍａ Ｒ， ａ ｗｎＳ ，ＨｕＧ，ｅ ａ Ｍｏ ｃｌｒ ａ ｅ ｄ ２］ｏ ｎ Ｎ Ｂ ｌ ｉ Ｌ ｄ ｔ １ ｌ ｕａ ｙｔ ｇｔ ． ｅ ｌ ｒ ｅ ａ ｏ ａ ｅ ｄ ｌ ｒｔ ｅ ｃ ｔｌｔｃ ｅ ｔ ｌ ｉ ｐ ｃｆ ｌ ｔ ｖ ｄ ｔ ｉ ｙ 到一个 理想 的可 以用 于 临床 的安 全有效 的方 法仍 是今后 研 ｎ ｎ ｅ ￣ｉｍ ｅｉ ｅ ｈ ｙ ｏｙｉ ｐ ｐ ｉ ｅ ｍｅｉｔｎ ｓ ｅ ｉ ｃａｌ ｏ 究工作 的重 点。期望 Ｍｅｔｎ这一 具有 广泛 生物活 性 、 用 ｔ ｒｃｉ ｎｍｉ ，ｒ ｕ ｉ ｕ ｏ ｒｗｈ 【． ｌ ｎｅｔ ｌｔ ｉｉ 药 ｕ ｅｌ ｉ ｃ ｍｏ ｓ ｅ ｅ ｃ ｇｔｍ ｒ ｏ ｔ Ｊ ＪＣｉ Ｉｖｓ， ｄ ｎ ｇ Ｊ ｎ ２０ ， １ （ ： ８０ ２４ ０ ９ １ ９ ９） ２ ３ － ８ ２ 功效强 大 的药物能 够早 日进 入抗 肿瘤 临床 的应用 。 ［１张晨 ， ２］ 李柏 ， 黄雪强， Ｍ ｌｔ 等．ｅｉｉ ｔｎ对肝癌细胞 Ｂ Ｌ ７ ０ Ｅ 一４ ２的增 参考文献 ｆ１ １王硕 丰 ， 杨本 明 ， 李立标 ． ｌｔ Ｍｅｉ ｎ的 药理 作 用研 究及展 望 殖抑制作用ｍ＿ 江中医药大学学报 ，０ ７ ３ （ ） ６ — ６． ｔ ｉ 浙 ｌ ２ ０ ，１５ ： ０ ５ ４ ５ ｆ２ 亚华 ， 竞南， ２１ 赵 董 崔红 ， 改造 的 Ｍ ｌｔ 等． ｅｉｉ 因在毕赤酵母 ｔｎ基 ｆ ． 津药学，０ ３ １ （ ） ３ ５ ． Ｊ天 ］ ２ ０ ，５ ４ ： — ７ ５ Ｊ ］ ２ ０ ，９ ２ ［］ ｂｒ ａ ｎ Ｅ ｅ ｎ ａｐ ｖｎｍｓＪＳｉｎｅ １７ ，７ 中分 泌表 达及培 养条件研 究 ［ ．生命科 学研 究，０５ （ ）： ２Ｈａｅｍ ｎ ．Ｂ ｅ ａｄ ｗ ｓ ｅｏ 】 ｃ ｃ ，９ ２ １７ ｆ． ｅ
［６ Ｔ ｒ ｅ ｔ ，ｅ １ ｎ ｏｉａｔａｔ ｉｅ ｆｖｒ ｕ ｘｒｃ ｌ ｓｅ ｉＪＴ ｅｍ ｃ ｉ ｃ ｃａ ２ ０ ， ７ ： ５ ３ ］ ｅｍ ｎ ｉ ｔａ． ｔ ｘ ｎ ｃ ｖ ｉ ｏ ａｉ ｓｅｔ ｔ Ａ． ｚ Ａ ｉ ｄ ｉｔｓ ｏ ａ ｓ ｉ ｅｄｏｌ］ ｈｒ ｏ ｈ ａＡ ｔ， ０ １ ３ ０１ ． ｎ 【． ｍｉ ３
意大利蜜蜂毒液含有 十多种生物活性肽 ， 以及 五十多种酶 倍 。 类物质 ， ｌｔ （ ｌｔ ） Ｍｅｔｎｍｅ ｔｎ 是其 中含量最多 的生物活性多肽 ， ｉｉ ｉｉ 占 ２合成杂合肽 蜂毒干重的 ５ ％ｏ ０ １ ｌｔ 。Ｍｅ ｔｎ由 ２ 个氨基酸残基组成 ， ｉｉ ６ 其氨基酸 Ｍｅ ｔｎ的 Ｎ端具有疏水 性 ，可垂直插入到 细菌质膜 内， ｌｔ ｉｉ 序列为 Ｇｙ Ｉ — １— １— ａ Ｌ ｕ Ｌｓ Ｖ １Ｌ ｕ Ｔ ｒＴ ｒＧｙ 使细菌死亡 ； ｌ－ｌ Ｇｙ Ａ ａ Ｖ １ ｅ — ｙ— ａ ｅ － ｈ－ ｈ— ｌ— ｅ 一 一 同时 ， 杂合肽 没有抗原性 ， 此 而有热稳定性 ， 不仅 ｋ ｕ Ｐ ｏ Ａｌ — ｕ ｅ ｓ Ｔ ｒ ０ｌ — ｙ － ｇ Ｌ ｓ Ａｒ — ｎ Ｇｌ — 去除 了 Ｍｅｔｎ的溶 血作 用 ， ＿ ｒ － ａ ｋ 埘 － ｅ ｐ ｅ Ｌ ｓ ｈｒ － ｙ — ｇ Ｇｌ — ｎ ｌｔ ｉｉ 更可 以拓宽其抗菌谱 。 宋旭霞等 ＮＨ１ 。分子式为 Ｃ３ ０ Ｌ ｌ 分子量为 ２ ４ ，Ｈ １ 。Ｈ ｂ ｒ ａｎ 制备 了 Ｍｅ ｔｎ与基 因变构 Ｉ 一 （ ｌｔ —Ｓｒｌ－ ） Ｈ ８ ０ｐ ０ ａ ｅｍ ｎ ｌｔ ｉｉ Ｌ ２ ｍｅ ｔ Ｓ ｇＬ ２ 的嵌合蛋 ｉｉ Ａ ｎ － 等最早从欧洲蜜蜂 Ａ ｉｍｅ ｉｒ ｐｓ ｌｆ ａ的毒液 中分离出 ， ｌｅ 此后 ， 人们 白， 研究其生物学 活性 ， 并 证实该嵌合蛋 白体外 可增强 Ｎ Ｋ细 对它的结构功能做 了大量 的研究。 胞 的杀伤活性 ， 促进 Ｔ细胞 的增 值 ， 抑制人卵巢癌细胞的生长 既往研究 表明 ， ｌｔ Ｍｅｉｉ ｔｎ具有 抗茵抗炎 、 镇痛 、 病毒等广 增殖 ， 抗 作用 明显优于 Ｉ－ 。 Ｌ ２ 可能是重 组后 的嵌合蛋 白中有了蜂 泛生物活性［１同时 ， ３， － ７ 它对多种肿瘤细胞 的增殖也 具有较强 的 毒素发挥协同作用 ， 直接抑制 了肿瘤 细胞 的增殖 ， 而单纯 Ｉ一 Ｌ２ 抑制作用 ， 以有效地抑制骨 肉瘤 细胞 、 可 胃癌细 胞 Ｓ Ｃ ７０ 、 不能在体外 直接抑制肿瘤细胞增殖 。 Ｇ 一 ９ １ 肺癌细胞 Ｎ ＩＨ１９ 、肝癌细胞 Ｓ Ｃ— ２ ９ ＭＭＣ ７ ２ 、 ｅ一 ４ ２的增 一 ７ Ｂ ｌ７０ Ｂ ｍａ ｏ ｎ的研究小组叨曾通过化学合成方法将一种抗菌肽一 殖， 诱导其凋亡［２促进 Ｉ一 ８１ －； １ Ｌ ２生成 、 Ｋ细胞增殖 ， 导 Ｔ细胞 抗菌肽 Ａ （ｅｒｐｎＡ） 的第 １ Ｎ 诱 ｃｃｏｉ Ｎ端 至第 ７位氨基酸与 Ｍｅ ｔｎ ｌｔ ｉｉ 增殖分化 ， 增强细胞免疫功能和抗肿瘤活性Ｉ ｌ ３ ～。因此 ， ｅｉｉ Ｎ端第 ５至第 １ Ｍ ｌｔ ｔｎ ２位氨基酸连接起来 ， 形成杂合肽（ Ａ ， Ｃ Ｍ）其抗 是一个 十分具有应用前景 的抗肿瘤天然药物 。 菌活 性得 到增强 ； 此后 ， 李燕 红等 跏在此基 础上 ， 将杂合 肽 但 是 由于 Ｍｅ ｔｎ结构 中没有 羧基组 ，分 子 中含有 ３个 （ Ａ ｌｔ ｉｉ Ｃ Ｍ）基 因克隆到 ｐｎ Ⅲ ・ ｍ Ａ 分泌表达载体 的 Ｅ ｏ — ｉ一 Ｏ ｐ ｃＲ Ｉ 赖氨 酸和 ２个精 氨 酸残基 ， 使它 成为一 种强 碱性 肽 ， 有较 Ｂ ｍＨ Ｉ 具 ａ 位点 间 ， 实可 以表达 出有抑菌 活性 的产物 ， 能保 证 并 强 的溶血副作 用 。而其溶 血作 用 主要是 通过 裂解 细胞膜 完 持部 分 Ｍｅｔｎ的活性 ， 无溶血作 用 ， ｌｔ ｉｉ 且 但其表达产量有 待提 成， 主要是 通过地毯式 和穿孔模 型［ １， 直接作用 于细胞磷 高 。 ａｉ ａＩ １ ８能 ７１ ， Ｌ ｖ ｎ ｃ 哈成 了聚酰胺 一 ｌｔ ｇ Ｍｅｉｉ ｔｎ复合物 ， 证明其存在抗肿 脂膜使 之裂解 ， 从而抑 制细 胞生 长发育 。但 是 ， 然纯 化的 瘤活性 ， 可消除溶血作用 。Ｃ ｏ － 抗菌肽 Ａ和 Ｂ的 １ ７ 天 且 ａ 等ｐ 将 Ｍｅｔｎ浓度在 １ ／ ｌ 即可使鸡 红细胞 发生溶血 ，浓 度达 号氨基酸与 Ｍｅｉｉ ４至第 １ 位氨基酸连接起来形成一种 ｌｔ ｉｉ ｇｍ 时 ｌｔ ｔｎ第 ｌ 到 ７ ｇＩ 时完全溶血 ； 人脐 血红 细胞 ， ｌｔ ／１ ｌ ｌ 对 Ｍｅ ｔｎ的致 半数 杂合肽 ， ｉｉ 由于有 Ｍｅ ｔｎ的加入 ， ｌｔ ｉｉ 使其抗菌活性增强了不少。但 溶血 浓度为 ０ １ Ｍ（ 等 于 １ ｔ ／ １ ， Ｍｅｔｎ体 外抑 缺点是这样的合成成本较 高 ， 以在临床上推广 。 ．１ 约 ５ｘ ．ｘ ｍ ） 而 ４ｇ ｌｔ ｉｉ 难 制肿瘤细胞 的有效浓度 一般在 ４ ８ ｇｍ 以上ｌ ， 血副作用 ～ １／ｌ ｘ １溶 １ 】 死亡素是 昆虫抗菌肽 中最广 谱的一种抗菌肽１ ， ３ 张莉等Ｉ － ２ ］ 轫 成为 限制 Ｍｅｉｉ 向临床 的主要障碍 之一 ，如何减轻 或消 将死亡素基因重组 质粒 ｐ Ｔ ２ ａ ， ｌｔ ｔｎ走 Ｅ 一 ８ 上 构建死亡素 一 蜂毒素杂合 除其溶血副作用是广大研 究者研究 的重 点。 肽 ，以包涵体方式转化 到大肠杆菌表达 ，可 以获得较高的产 １改 造 结构 量， 且蛋 白纯度较高 ， 可以提 高疗效 。 嵬等 从噬菌体 十二肽 刘 】 Ｄｍ ｓ Ｍ ｌ １ 位 的 Ｐ０ ｅ ｐ ｙ嘴 ｅ第 ４ ｅ ｒ换成 Ａａ希望使 Ｍ ｌｔ 库 中筛选 出与 ＭＭ 一 ｌ， ｅｔ ｉｉ ｎ Ｐ ２具有 高度亲和性 的十二肽 ，与 Ｍ ｌｔ ｅｉｉ ｔｎ 的 １０旋光角消失 ， ２。 导致改造后 的 Ｍ １ ｅ溶血 作用 却增 加了 ２ 连接 ， ． ５ 证实在大肠杆菌 中可 以进行 高效表达 ； 并分别通过凝胶 倍。ｌ ｄｎ 掉 Ｍ ｌ Ｂｏ ｅｅ ｎ ｅ氨基 酸序列 中第 ６ Ｌｕ第 ７ Ｌｓ 层析 、 位 ｅ 、 位 ｖ、 亲和层析 、 肠激 酶酶切获 得高纯度 的多肽 ， 体外抑 瘤实 第 ８ Ｖ ｌ第 ９位 Ｌｕ 第 １ 位 ａ、 ｅ 、 ３位 Ｌ ｕ 第 １ ｅ 、 ６位 Ｌ ｕ 第 １ ｅ 、 ７位 验证 明 融合 蛋白可以明显抑制 肿瘤 细胞 的生长。 该 ｎ 和第 １ 位 后 ， ｅ ９ ｎ 得到 的 Ｍ ｌ ｅ类似 物 ， 溶血活 性下降很 ３结 语 其 多 ， 同时抗菌作用也略有下降 。而删去 Ｍｅ 氨基 酸序列 中第 但 ｌ 蜂毒 ， 是虫 类药 的重 要组成 之一 ， 自《 出 吉林 中草药》 其 ， １至 １ １ ５位及第 ２ 至 ２ 氨基 酸得到 的 Ｍｅ 类似 物对溶血 味辛 、 ， １ ６位 ｌ 苦 性平 ， 有毒 ， 归肝 、 肺经 。具有祛风湿 、 止疼痛 的功效 ， 作用却没有影响。 常用于风湿性关节 炎、 腰膝酸 痛、 坐骨神经痛等疾病 。蜂毒疗 此后 ， 赵亚华圄等根据 Ｍｅ ｔｎ在微摩 尔浓度下 通过地毯 法治疗某些 自身免疫性 疾病 也是历史悠久 。Ｍｅ ｔｎ ｌｔ ｉｉ ｌｔ 就是蜂毒 ｉｉ 式和穿孔模 型破坏 细胞 和脂 质体这种侵膜机制 ， Ｍｅｉｉ 对 ｌｔ ｔｎ分 的主要成分之一。 但是 ， ｌｔ Ｍｅ ｔｎ的溶血副作用长久 以来一直是 ｉｉ 子 中的氨基酸序列进行 了改造 ， 在其序列 的 仅 螺旋结构 区域 其进入 临床 的绊脚 石 ，研究者们对于如何 降低其溶血 副作用 一 将第 ５位 的 Ｖ ｌ ａ 替换 为 Ａ ｇ 第 １ 的 Ａ ａ替换 为 Ａ ｇ 同 时 至今做 了很多 的研究 与探索 ， ｒ， ５位 ｌ ｒ， 但有 些仍然局限于基础研究 ， 且 删除了第 １ ６位对溶血活性有影响 的 Ｌ ｕ 通 过降低螺旋 度 ， ｅ， 正 体外 实验 多于体内实验 ， 鲜有 见到临床研究的报道 ， 而有些方 电荷数增 加使其对 膜作 用更多倾 向于地毯模 式 改造后 的 法 的不 足、 一， 成本过高等缺 点也 限制了这些方法的发展 ， 有待进 Ｍｅｔｎ序列 为 ： Ｉ Ａ Ｌ Ｖ Ｔｒ Ｌ Ｒ Ｓ Ｋ Ｋ Ｑ ｌｔ ｉｉ Ｇ Ｇ Ｒ Ｋ Ｌ Ｇ Ｐ ＩＷＩ Ｒ Ｒ Ｑ。改造 的 步 的解 决 与 完 善 。 Ｍ ｌｉ其溶血活性与标准样 品的溶血活性相 比，降低 了 １３ ｅｔ ｉｎ ｔ ４ ． 我 们认 为 ， 入 研究 Ｍｅｔｎ的构 效关 系 ， 深 ｌｔ ｉｉ 也许 是 实现
一
ｂ ｎ ｏ ｌｔｄ ｄ ｒ ａ ｖ ｓ ｆ ｐ ｌｓｃ ｈ ｒｄ ｅ ｔａｔｄ ｒｍ Ｕｌａ ａ ｄ ｒ ｃ ｏ ｓ ｆ Ｓ ｒ ｕ ｄ ｍｅ ｆ ａ ｆｕ ｔ ｔ ｉ ｅｅ ｔ ｅ ｚｙａｅ ｅ ｖ ｔ ｅ ｏ ｏｙ ａ ｃ ａｉ ｅ ｘｒｃｅ ｆ ｉ ｉ ｏ ｖ ｎ ｆ ｔ ｎ ｏ ｏ ｂ ｓ ｏ ｓ ｃ ｒ ｉ ａ ｄ ｆ ｒｎ ｍａｕ ｔ ａｉ ｉ ｓ ｔｒｙ ｉ
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北方药学 ２ １ ０２年第 ９卷 素 溶 血 作 用 的研 究 进 展
王傅 李 柏 １ 海中 （ 上 医药大 上 ２１ ３ ． 二军医 ． 学 海 ０２ ； 第 ０２ 大学附属 长海医院中医 上海 ２Ｏ３ 科 ０４ ） ３
摘要 ： 蜂毒素（ ｅ ｔｎ 是一种具 有抗 茵、 ｍ ｈｔ ） ｉ 抗病毒 、 炎镇痛 、 抗 抗肿瘤等广泛生物活性的天然 生物活性物质 ， 但强烈的溶血 副作用 制约 了其走 向临床 ， 本文就近年来对降低 Ｍｅ ｔｎ溶血等毒 副作 用， ｌｔ ｉｉ 并能保持抗肿瘤 活性做的各种改进方式做一综述。 关 键 词 ： ｅｉｉ 降 低 溶 血 综 述 Ｍ ｌｔ ｔｎ 中图分类号： ９ Ｒ９ 文献标识码 ： Ｂ 文章编号 ：６ ２ ８ ５ （ ０ ２）５ ０ ３ — ２ １ ７ — ３ １２ １ ０ — ０ ９ ０