小鼠肿瘤模型

肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。

小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

1. 关于构建瘤种

可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。

2. 关于腹水传代

观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml 注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。

3. 关于接种进行试验

这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操

作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。

4. 关于观测指标

主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA的规定，平均瘤重小于1g，或者单个瘤重小于200mg，认为肿瘤生长不良，试验作废。

小鼠模型第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和接种做试验。有一种做法也是接种后第二天开始给药，还有一种做法是接种三天后给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。

1. 关于瘤种构建

体外细胞株，培养后PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/site，接种至小鼠腋下，即可。

2. 关于传代与接种

剥取肿瘤，在PBS中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀剪成小块，小块大小以套管针的针口为标准。用镊子将小块从针头处塞进18~20号的套管针，接种至小鼠腋下，用套管针中间的实体针将瘤块推出即可。

还可以在上述肿瘤组织剪成小块后，用玻璃匀浆器匀浆后，200目筛网过滤，收集滤液，活细胞计数，PBS稀释后用注射器接种，稀释量也需要各个实验室自己摸索。

也是三代后可用于试验。

3. 关于观测指标

可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。

小鼠模型第三类是以P388、L1210为代表的白血病模型。宿主为DBA2，也有人用C57与DBA2的F1代传代，DBA2用于试验，但是我们两种宿主都传过代，没有发现有什么区别。他们能形成腹水，一般不用于皮下接种试验，平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。也是接种后第二天开始给药

这个就不细说了，很多可以参考第一类，主要几点就是，他们的腹水都是血性的。另外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一到两毫升的PBS后，再抽取。

肿瘤模型构建

小鼠模型分三大类

第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接种后第二天开始给药（这里与指导原则相悖，指导原则要求肿瘤长至100-300立方毫米时才给药），给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

1. 构建瘤种

可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。细胞悬液接种时要选活力好的细胞，就是对数期。细胞生长至瓶底70~80%满的时候认为是对数生长期。

2. 腹水传代

观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，

让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整。

第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于试验。腹水瘤接种时，接种量不要太高，1*107/ml，0.2ml 即可，多按1：3用生理盐水稀释，否则有可能腹水血性。超过7天的腹水再传代，动物的周龄太大（>6周）,传代次数太多也很容易出现血性腹水。一般小鼠肿瘤模型都控制在30多代以内（也有说50多代的）。出现血性以后可以调整一下：血性腹水可以离心后加0.17N的NH4CL溶液破红细胞，然后精确控制条件（接种量，传代时间，动物周龄等）传几代，很多情况下再传一两代后会有无腹水血性的种鼠出现，然后用这只种鼠的腹水继续传代。

腹水难抽有几种情况，要么接种天数不够，腹水不够多，一般要等动物肚子很大了才去抽。要么就是压力的问题。有的动物腹水很稠。这时可撕开小鼠肚子，拿掉针头，直接抽干净，最多的时候可抽到5ml。

3. 接种

这个时候抽取的腹水需要量比较多，有时需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数（计数的时候要注意，有一些很细小的细胞是血细胞，不要计数）。如果接种细胞量偏大会造成肿瘤早期就溃烂，所以不要为了追求肿瘤生长速度而一味的提高接种细胞量。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。可以往尾部或背部靠一些，不要往腹部靠，容易使肿瘤被垫料磨烂。接种部位可以选择腋下或者后肢,有的文章说是背部接种,但是背部血管不发达,营养不够,一般不建议采用.

接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应该在两者之间，接种的时候要精确控制接种在皮下，进针深度1.5cm左右, 针头沿皮肤水平进入,然后挑起表皮,注射。进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。

防止接种的时候老鼠乱动，正确手法是用拇指和食指捏住老鼠的颈部皮肤，无名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住，捏颈部的时候手指尽量多捏一点皮肤，然后右手（你是左手抓动物的话）拉住后肢，尽量往下拉，让老鼠的身体伸展开来，在用无名指固定，中指可以放在老鼠的身体下面，适当的往上顶，使老鼠的腋下一代完全平展，皮肤不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时候进针点很靠下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能动就