细胞组织切片及观测方法(实验教材)

生物显微技术讲义
生物显微技术是高等院校生物系各专业的基础课,包含生物材料固定技术、生物染色技术、各种显微切片制作技术、显微化学技术显微摄影技术。

通过这门课的学习，希望能够帮助大家加强生物实验的技能。

使学生掌握制作动、植物显微切片的技术,掌握使用光学显微镜及进行显微摄影所必备的基本理论、基本知识和基本技术。

本《生物显微技术大实验》是为了配合这门课的教学，在参考了国内一些相关教材的基础上，结合本教研室的历年实验经验与心得而编写的，仅供唐山师范学院生命科学系学生使用。

生物显微技术的内容在其他教材中叙述比较零乱，没有统一的整体性。

本指导在结合我系教学安排和实验的前提下，有针对性的安排了生物显微技术的理论教授和实验指导。

内容主要包括石蜡切片的制作、显微摄影知识、数码显微镜及软件的使用。

由于编者业务水平和工作经验所限，虽然做了大量努力，书中难免还会存在缺点和不足。

为此切盼广大师生在使用本书过程中能提出批评和建议，以备在以后的日子里改进和提高。

编者
第一章生物制片 (4)
第一节前期准备 (4)
第二节生物制片分类 (8)
第三节石蜡切片 (10)
第二章显微摄影技术 (37)
第三章暗室技术 (48)
第一节感光材料 (48)
附彩色显微摄影和黑白显微摄影的相关知识 (53)
第二节暗房工艺 (57)
第四章数码显微摄影 (64)
实验一徒手切片与整体制片法.......... .. (66)
实验二1、石蜡切片技术—固定、染色、返蓝 (70)
2、石蜡切片技术—脱水、透明、浸蜡、包埋 (72)
3、石蜡切片技术—切片、粘片、脱蜡、透明、封藏74
实验三显微摄影及暗室技术 (78)
实验四数码显微摄影及研究分析软件的使用 (88)
实验五所作切片的观察照相、提交作业 (99)
第一章生物制片
第一节前期准备
一、玻璃器皿的清洗：
（一）生物学实验使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干净, 应以壁面被水均匀润湿而无水珠为标准。

表1-1一般器皿的洗涤方法
玻璃器皿经洗涤液清洗后→自来水冲洗→蒸馏水冲洗→倒放于大张滤纸上晾干或玻璃仪器烘干器烘干。

（二）洗液配法：重铬酸钾 20g
浓硫酸 100ml
清水 100ml
先将重铬酸钾溶于水中，在一滴滴加入浓硫酸，边加边搅拌，颜色为红褐色放于玻璃容器内可反复使用，一直到颜色变为蓝黑色为止。

（三）新旧载玻片及盖玻片的清洗：
1．新的：2%盐酸酒精（95%酒精100份加浓盐酸2份）浸泡几个小时→流水冲洗干净→95%酒精中待用。

2.旧的：没用树胶封片的：洗衣粉煮沸5-10分钟→清水冲洗→洗液30分钟→流水冲洗→蒸馏水洗净→95%酒精中待用。

3.树胶封片的玻片：二甲苯浸泡、洗净→95%酒精中待用。

二、溶液的配制：
（一）百分比浓度 :质量百分比浓度。

即100g溶液中所含溶质的克数。

1.稀溶液的配臵：
例1：1%的番红水溶液—即将番红1克溶解于100 ml的蒸馏水中。

例2：0.1%固绿酒精溶液—即将固绿0.1克溶解于100ml的95%酒精中。

2.浓溶液的配臵：配臵高浓度的溶液，应在100ml的水中减去溶质重量的水。

例：15%NaCL称取15gNaCL,溶于85ml水中。

（二）摩尔浓度：1升溶液中所含溶质的mol数。

用M表示。

例：配制500ml 2M NaCO
3
溶液
称取2×106×0.5=106g NaCO
3
溶于500ml水中。

（三）当量浓度：1升溶液中所含溶质的克当量数。

用N表示。

当量（E）与分子量（MW）的关系：E=MW/n
其中酸的n为酸分子中可被金属取代的氢原子数
碱的n为碱分子中金属的原子价
盐类的n为盐分子中金属的原子数乘金属的原子价
如：HNO
3
的当量=63/1=63
H 2SO
4
的当量=98/2=49
Ca(OH)
2
的当量=74/2=37
Al
2(SO
4
)
3
的当量=342/2*3=57
一般溶液的配制用烧杯、量筒；准确溶液的配制用容量瓶。

(四)酒精稀释法（交叉稀释法）：
95%酒精→83%酒精
先在量筒中加入83ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→70%酒精
先在量筒中加入70ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→50%酒精
先在量筒中加入50ml95%酒精,再加水至95ml即得。

95%酒精→35%酒精
先在量筒中加入35ml95%酒精,再加水至95ml即得。

（五）常用液态酸的配臵：
表1-2常用液态酸的配制
三、制定实验计划：
制定计划时首先要考虑到制片的目的，其次是选择制片的标本，最后才是确定具体的制作方法。

例如制玉米茎的横切面，其目的在于观察维管束的结构，那么就应选择老的茎作标本。

又如作某一种叶子的生态解剖，所选择的标本就不应该再同一地点，应在不同环境条件下多采集几份，才好做比较。

由此可见制片的目的与标本选择有密切联系，有时甚至二者是需要同时决定的。

最后可根据目的要求及所选择的标本确定具体制片的方法。

一般讲，制片技术的方法虽然很多，但对某一材料来说可能多不是十全十美的。

因此我们在制定计划时，不妨多采用几种方法，以便比较。

同时也要注意经济原则。

方法确定后，在计划中还需将所用的药品、用具等名称及数量逐一列出，然后在定出具体的工作日程。

制订试验计划需要比较丰富的知识和经验，所以在订计划之前，必须要阅读参考文献，深入钻研。

初学者可在有经验的老师指导下制订出比较完善和精密的实验计划。

（四）日程与记录：
制片是一个连续的过程，从标本的采集、固定、切片、染色到封藏为止，往往要连续几天，如果事前没有工作日程、就会造成混乱。

除编排日程表外，还必须将工作过程中的实际情况连同日程表都详细的记载在记录本上。

这样可根据结果检查实际工作中的问题所在，总结失败原因，也可以总结成功的经验。

所以日程表和详实地记录对制片工作来说，是一件非常重要而且必须长期坚持的工作。

这些记录不仅要详实，而且还要作为档案保存起来。

第二节生物制片分类
一、生物制片的分类:
（一）切片法:
1.徒手切片:尽量切薄,切一层细胞,此法多用于植物切片的临时观察。

2.石蜡切片：4-12μm厚，用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，用旋转切片机把蜡块切成薄片。

3.半薄切片：0.5-1μm厚，用树脂包埋。

用途:在光镜下观察尽量薄；为超薄切片定位，因为其制片技术和超薄切片一致。

4.冰冻切片：使组织内部及周围的水份结冰，组织变硬，然后用切片机切成薄片，制成切片，此法制作步骤少，用时短，不经脱水和透明，故对脂类无影响。

常用于临床快速病理分析。

5.木材切片：10-20μm厚，很硬，需软化，用50%酒精：甘油=1：1软化几天，滑行切片机切。

6.火棉胶切片：用火棉胶包埋组织，滑行切片机切成薄片，主要用于大块组织切片。

（二）非切片法:
1.整体装片法：对于小的动植物体或较大动植物体的一部分，不经切片而直接制成玻片的方法。

如昆虫口器、水螅、藻类、植物叶、茎表皮细胞。

2.涂片法：对于流动和半流动的材料，不能切片，而直接将材料涂成玻片标本，干燥后进行固定、染色及封固。

如血液、细菌、骨髓。

如图1-1。

3.压片法：将一些柔软的材料臵于载玻片上，盖上盖玻片，用一定的压力将标本压碎或压开，制成玻片的方法。

如洋葱根尖染色体观察，果蝇唾腺染色体观察。

4.伸展法：一些成膜状结构的标本，使它展平放在载玻片上，撕开、展平制成铺片标本，待干燥后经固定、染色后制成玻片标本的方法。

常用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织。

如图1-2。

5.磨片法：主要用于含有钙盐等矿物质，成份坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿、骨等用磨石磨成薄片，再封固成玻片。

如图1-3。

6.分离法：为了观察研究组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须设法使细胞与细胞间质分离，细胞便各自分离开来，再经染色制成玻片标本的方法叫分离法。

一般分为化学分离法和撕碎法两种。

如神经细胞分离装片，平滑肌细胞分离装片。

图1-1涂片法图1-2展片法图1-3磨片法
第三节石蜡切片
石蜡切片过程：
取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→脱蜡→染色→脱水→透明→封藏
一、取材：
（一）生物组织取材的注意事项：
1.取材应遵循准确、典型、完整、适时的原则。

2.研究正常结构应选取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料时，除取病理部位外，还应选取正常部位，以利于对照观察。

3.取材前，要根据要求选择并配制好固定液，取材后，立即投入固定液中，以防组织自溶和腐败。

4.切取材料时，刀必须锐利，动作要快且仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取也应轻拿轻放，避免材料的损坏。

5.取材要详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、断面和所用固定液等。

（二）植物材料的取材：
1.固定前对材料要进行切割：
原因：
（1）为了固定更容易
为保证下一步固定材料能迅速的杀生和固定，务必使各细胞立刻停止生命活动，而不使原生质有崩解的现象。

普通应用的固定液对于植物体外表面的角质、木栓质等的穿透很慢，但对于被切割的表面，则穿透速度快很多。

所以，我们在固定材料的时候，应将所需要的部分分割到最小块、段或片、以达到立刻杀生与固定的目的。

（2）石蜡块也有一定限制，一般（5-6mm）。

2.切割面一般分为两类：
（1）横切面：使用刀横越根、茎的横断面的切面，横切片可观察材料自外向内的各种组织。

（2）纵切面：刀的切向与根、茎的长轴方向平行的切面，这种切面又分为两种：
①半径切面：以刀穿过中心点与其半径吻合的切面，这种切面可观察到茎中各种组织纵走的情形及髓的排列、厚度等。

②切线切面：以刀沿植物体的表面与其半径成直角所切的切面。

3.不同材料的切割方法
（1）叶片：叶片宽小于1cm,可沿主脉横切3-5mm
叶片宽大于1cm,可分割成许多片，选其中含主脉和侧脉的固定，一般5-7mm2方块。

（2）圆柱形材料：直径小于2mm，有角质层的，切2mm厚。

无角质层的，固定液穿透容易，切5-10mm厚。

直径大于等于5mm，切5mm厚。

直径大于10mm,切2-5mm厚。

直径很大，取楔形
（3）木质小枝：直径小于5mm，切成15mm长
木条和大枝：直径较大的,切成2-3cm厚，再分割成楔形小块。

（三）动物取材：
活体直接取材、麻醉后取材、处死后取材。

无论采取那种处死方法，多应避免由于痛苦引起挣扎，而造成组织结构发生变化，同时取样必须迅速，越快越好。

因为动物一旦死亡，细胞便开始自溶。

二、固定（fixation）:细胞生命现象的突然终结，并保持生活状态的形态和结构。

（一）固定的目的和作用：
1.可以防止细胞自溶和腐败，在整个制片过程中保存细胞内的各种内含物。

2.增强细胞对各种浓度渗透压的抵抗能力。

3.可使细胞成份沉淀和凝固，因而产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得原来看不清楚的一些结构清晰起来。

4.有些固定剂可使细胞各部分容易染色。

（二）作为固定液的条件：
1.对组织细胞渗透能力强，立即将细胞杀死。

2.细胞内含物不能发生变化。

（不能是细胞内某些成份的溶剂。

）（酒精是脂类物质的溶剂，所以单独使用时收到一定的限制。

酒精不适宜作膜结构观察的固定剂）
3.尽可能避免组织或细胞膨胀或收缩。

4.有利于增加细胞内含物的折光程度，增加媒染作用或染色能力。

5.使材料适当变硬，并具有一定的坚硬性便于切片。

（三）按固定的方式将固定液分为两类：
凝结型固定液：使蛋白质凝固，形成悬浮颗粒网状混合液。

非凝结型固定液：不使蛋白质凝固，形成透明的凝胶。

苦味酸、升汞、铬酸、碘均能使胞质蛋白和核蛋白凝固；酒精能沉淀胞质蛋白，而核蛋白沉淀后溶于水；醋酸不能凝固胞质蛋白但能凝固核蛋白;福尔马林、锇酸、重铬
酸钾对两种蛋白都不凝固。

1.凝结型固定液：
（1）酒精:(alcohol)70%-75%酒精渗透力最强。

特点：①穿透速度快。

②可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前两者所生成的沉淀不溶于水，核蛋白所生成的沉淀溶于水；所以经乙醇固定的标本对核的染色不良，不适于对染色体的固定。

③浓度50%以上的酒精可溶解脂肪和类脂体。

不能用于膜结构的研究，溶解血色素，破坏其他多种色素，所以不能用于脂肪、类脂类和色素的固定。

一般用于组织学观察。

④使糖原沉淀，但能溶于水。

⑤是还原剂，在混合固定液中，酒精不能与氧化固定液混用。

如铬酸、锇酸、重铬酸钾等。

⑥使材料硬化、组织收缩明显。

⑦固定材料适宜浓度为70%-100%。

固定后不需冲洗，70%的酒精可较长时间保存，若长期保存材料与甘油等量混合后使用。

70%酒精：甘油=1：1
（2）醋酸（acetic acid）
特点：①穿透力速度极快。

②能固定核蛋白，对胞质也存在固定作用。

对核蛋白是凝结型固定液，对胞质是非凝结型固定液。

使染色质和染色体的固定和染色均很好，因此所有固定染色体的固定液中几乎都有醋酸。

③对脂类和糖类无固定作用。

④酸性
⑤对材料不但不硬化还有软化作用。

对细胞无收缩作用，稍有膨胀作用。

可防止其他药剂如乙醇、甲醛、铬酸等引起组织收缩。

⑥固定后不需冲洗，可直接投入70%的酒精中保存。

⑦固定材料适宜浓度为0.3%-5%。

（3）铬酸（chromic acid）
特点：①穿透速度缓慢。

②能沉淀所有蛋白质，凝固核酸，增强核的着色能力，可作为核蛋白核核酸的固定液。

能固定高尔基体及线粒体。

常用于细胞学观察。

③只有铬酸能真正固定肝糖原，使之不溶于水。

对脂类无影响；
④氧化剂，不能与酒精混用。

固定后投入酒精前必须用流水冲洗，直至组织中不含铬酸为止，如冲洗不干净或直接投入酒精中，被还原成绿色的氧化铬并发生沉淀，使染色困难。

⑤使组织硬化，细胞收缩。

⑥铬酸常配成2%或10%的水溶液作为储备液，固定适宜浓度为0.5%-1%。

（4）苦味酸（picric acid）三硝基苯酚，不能结晶保存，要以饱和溶液存放。

干燥时易爆炸。

特点：①穿透速度中等。

②可沉淀一切蛋白质。

对脂类无影响，对糖类无固定作用。

③细胞收缩明显，材料硬化程度很小。

④固定后不需冲洗，可直接投入70%酒精中洗去黄色。

⑤固定材料适宜浓度为饱和溶液，即0.9%-1.2%。

2.非凝结型固定液：（质量较好）
）
（1）锇酸（OsO
4
特点：①穿透速度很慢。

材料要切的小一些，约1mm3。

②不沉淀蛋白质，能使蛋白质被均匀固定，所以用锇酸固定的蛋白质能保持生活时的均匀性。

③是脂肪和类脂类的很好的固定剂。

④强氧化剂，易挥发，毒性大，对视网膜固定效果好，要保护好眼睛。

价格贵。

⑤不使细胞收缩，对细胞质固定好，固定物组织柔软。

⑥固定后流水冲洗12～24小时。

使其完全洗净，否则遇乙醇就发生沉淀。

⑦固定材料适宜浓度为0.5-2%。

锇酸的配制：用重蒸水配成母液2%，使用时，用PH7.0、0.2M磷酸缓冲液稀释一倍到1%。

（2）戊二醛：
特点：①穿透速度很快。

②固定微管蛋白，是微管的很好的固定液。

③用PH6.8-7.0、0.2M磷酸缓冲液配成25%母液，固定材料适宜浓度为3-6%。

（3）丙烯酸：
特点：①固定蛋白、核酸和聚多糖。

②固定材料适宜浓度为10%，用PH6.5的磷酸缓冲液配。

（4）甲醛：（不用于电镜制片）
特点：①穿透速度快。

②可与蛋白质化合形成不溶性的化合物而固定，固定脂肪和类脂类化合物。

③还原剂，不能与氧化剂混用。

④组织硬化程度显著，收缩小，但仅仅经酒精脱水后，收缩显著。

⑤固定后不需水洗，可直接投入70%的酒精。

但经长期固定的材料，需经流水冲洗1-2天，否则影响染色。

⑥市售的为37-40%甲醛，称为福尔马林，固定和保存材料的适宜浓度是10%福尔马林。

（四）混合固定液：
1.卡诺(Carnoy)氏固定液：
配方：纯酒精：冰醋酸=3：1
此液适于固定一般动物组织和肝糖原以及植物组织。

（多用于细胞学研究。

）穿透速度快，为防止组织硬化，固定时间不要超过24小时。

时间以材料的不同而有所区别，根尖15min,花药1小时。

糖原在3-5℃下固定4消失，小白鼠睾丸30-50min。

固定后可转入70%中保存，也可直接经95%酒精，纯酒精脱水。

2.福尔马林-醋酸-酒精混合液：（FAA）
配方：50%或70%酒精 90ml、冰醋酸 5ml、福尔马林 5ml
配方中福尔马林及冰醋酸的含量，经常根据材料而略加改变。

一般容易引起收缩的材料应多加冰醋酸而减少福尔马林的含量；坚硬的材料可略减少冰醋酸而增加福尔马林。

至于酒精的浓度应用的原则是：柔弱幼嫩的材料用低浓度，老年或坚硬材料用70%酒精。

如用作植物胚胎材料则其配方可改为：
50%酒精 89ml、冰醋酸 6ml、福尔马林 5ml
FAA是一种良好的固定液和保存液，差不多一般植物组织和器官都适用。

（适用于组织学观察，不适于细胞学观察。

）固定时间一般24小时，也可在此液中长期保存。

也可通过50%酒精、70%酒精开始脱水。

木质小枝枝枝必须固定1周。

固定后木质材料应在流水中冲48小时，并在50%酒精和甘油溶液（1：1）中浸2-3天，使其软化。

3.铬酸-醋酸中液：
配方∶10%铬酸水溶液 7ml 、10%醋酸水溶液 10ml、蒸馏水加至100ml。

此液用于固定根尖、小的子房及分离出来的胚珠等植物组织。

固定时间一般12-24小时，不能长期保存材料。

固定后流水冲洗12-24小时。

4.纳瓦兴氏液：（适用于组织学和细胞学研究）
甲乙液分开配，临用时再混合。

配法为：
表1-4纳瓦兴氏液的配方
纳瓦兴氏液，固定时间为24-48小时，如固定液呈暗绿色时，表示固定能力已经消失，其中铬酸被还原的缘故，仅有保存作用，固定后用70%酒精冲洗，再脱水。

纳瓦兴氏液ⅠⅡⅢⅣⅤ，固定时间为12-48小时，ⅠⅡ固定后用水冲洗，ⅢⅣ可用35%酒精冲洗，Ⅴ可用70%酒精冲洗。

桑弗利斯液，固定时间为4-6小时，流水冲洗6-12小时。

（五）固定时应注意的问题：
1.固定的材料越新鲜越好，立即固定。

2.材料与固定液比例一般为1：20。

3.根据材料的性质和制片的目的选择固定液。

4.有时要用蔗糖、氯化钠来调节渗透压。

5.材料外表有毛或其他不易穿透的物质存在，可先在含酒精的固定液中固定几分钟，再换用含水的固定液。

6.含有气体的材料投入固定液后，不下沉，须将气体抽出。

方法可采用真空泵，或用注射器的简易方法（将材料和固定液倒入10ml注射器中，插入活塞，用手封住出口，用手来回抽拉几次即可）。

7.材料固定后一定要做标记。

三、冲洗：
（一）目的：所谓洗涤，即用洗涤剂渗透到材料中，把固定剂洗掉，洗涤必须彻底，才能进行下一步操作。

否则留在组织中的固定液有的防碍染色，有的会发生沉淀物或结晶而影响观察，有的可以继续发生作用，破坏材料或影响以后的处理。

（二）洗涤的原则与方法：
常用的洗涤剂是水和低浓度的乙醇。

1.固定液用水配的，就用水或流水来冲洗；不需流水冲洗的材料，放在小瓶内，换数次水，每次1-2小时。

2.用各种浓度的酒精配的，就要用与固定液相近浓度的酒精冲洗；材料：酒精=1：10。

3.用福尔马林固定的不用水洗，但长期固定的，应充分水洗，否则影响染色。

4.用铬酸、重铬酸钾等固定的材料就用流水冲洗。

将材料放在广口瓶内，瓶口用纱布扎起，橡皮管一端接在水龙头上，一端插入瓶底，调节水的流量，是瓶内的水不断更新。

水流不要太猛，以免损坏材料。

冲洗时间应和固定时间相同或再长。

5.冲洗时间要根据固定液及材料的性质、大小而定，一般1-6小时。

四、脱水：就是用一种药剂把材料中的水份全部代替干净。

（一）脱水原因：在制作永久制片时，组织冲洗完毕后必须进行脱水，因组织固定和水洗后含大量水分，而水不能和石蜡包埋剂混合，组织内只要有极少量水份，就会防碍包埋剂的渗入。

第一步脱水：是为了引入包埋剂作准备。

第二步脱水：是为了引入封藏剂作准备。

（二）脱水的结果：
使材料变硬，形状更加稳定，利于组织永久保存。

除尽材料的水份，才能使透明剂、包埋剂、封藏剂渗透到组织中，有利于组织的透明和透蜡。

（三）脱水的方法：
脱水应逐步进行，而不能骤然进行，否则会引起组织的强烈收缩，或使材料变形。

一般把脱水剂配成各种浓度，材料自低浓度到高浓度依次经各级脱水剂，其中所含水份逐渐被脱水剂取代。

（四）脱水剂应具备的两个特性：
1.必须是亲水性，能与水以任何比例混合，代替细胞中的水份。

2.必须能和其他有机溶剂混溶取代。

（五）脱水剂分为两类：
1.非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇、丙酮等，组织脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。

2.石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇、二氧六圜等，组织脱水后即可直接透蜡，不需经过中间溶剂二甲苯之类的药品。

（六）常用的脱水剂：
1.乙醇：
（1）按浓度梯度依次进行15%→35%→50%→70%→83%→95%→100%→100%；
（2）脱水时的注意事项：
①脱水必须要在有瓶盖内进行，尤其是高浓度乙醇很容易吸收空气中的水份。

②组织由低浓度向高浓度的乙醇转移时，要用吸水纸吸干余液，以免将水份带入。

③纯乙醇中如有水，可加无水硫酸铜以吸去水份。

（3）在各级停留的时间：
第一步脱水，须看材料的性质大小而定，体积为2mm3的一般每级为1-4小时；
第二步切片脱水，每级只需3-10min；在低浓度酒精中，每级停留的时间不易过长，否则易使组织变软，助长材料解体。

从95%到100%乙醇后，时间不能太长，否则材料变
硬变脆，影响切片。

为使乙醇脱水彻底，应更换两次100%乙醇。

如需过夜应停留在70%酒精中。

注：在每级中停留的时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。

①如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约30min-1h。

若用苦味酸固定则可延长为1h。

②由FAA固定的草本茎，每级停留2小时，木本茎停留4小时，较大的木材每级延长为8-12小时。

③一般动物组织如小白鼠的肾脏2-4mm厚，每级停留1-2h。

④脱水至纯酒精时，需更换两次，每次30min-1h；材料大者，可多换一次。

由95%-100%时，瓶子上的塞子也应换干燥的，以免水份渗入。

2.丙酮：为很好的脱水剂，可以代替乙醇，其作用和用法和乙醇相似，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。

能使蛋白沉淀，组织硬化，不能溶解石蜡，所以仍需经过二甲苯或其他透明剂，然后才能进行浸蜡和包埋。

3.正丁醇：此剂易挥发，可与水和乙醇混合，亦是石蜡溶剂，可不经透明剂直接浸蜡。

但一般在应用上还未能完全替代乙醇。

多与乙醇按一定比例混合作脱水之用，但最后需经纯正定醇方可浸蜡。

很少引起组织块的收缩，变脆。

Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，仅Ⅴ级的用纯乙醇配。

Ⅱ中可过夜。

材料经两次正丁醇后，进入1/2正丁醇1/2石蜡，经1-3小时后，转入纯石蜡。

4.叔丁醇:可与水，乙醇及二甲苯等剂混合，(可套用上表)也可单独使用，是一种应用很广的脱水剂。

此液不会使组织收缩或变硬，不必经过透明，可直接浸蜡。

应用此剂可以简化脱水、透明等步骤。

因此已逐渐代替乙醇，但价格较贵。

表1-6各级浓度的叔丁醇：
Ⅰ-Ⅳ中的乙醇可用95%，仅Ⅴ级的用纯乙醇配。

材料经两次叔丁醇后，进入1/2叔丁醇1/2石蜡，经1-3小时后，转入纯石蜡。

举例：植物骨架光镜观察的实验中，若遇到效果好的片子，可通过以下步骤做成永久切片：50%乙醇→70%→95%→1/295%：1/2叔丁醇→叔丁醇→中性树胶（每级5-10min）。

5.甘油，也是一种良好的脱水剂，尤其对细小柔软的材料更适合。

用甘油脱水可以避免原生质收缩，但脱水前必须洗净固定剂，以免影响包埋和染色。

利用甘油脱水，可以从50%浓度开始至纯甘油，再换纯乙醇。

6.二氧六环：为无色液体，易挥发燃烧，且有毒，应尽力避免吸入它的蒸气。

能与水和乙醇在任何比例下混合，为石蜡溶剂，脱水至纯二氧六环后，即可进行包埋。

浓度梯度设计为：30%→50%→70%→90%→100%→100%→100%每级时间为1-6小时。

五、透明：
材料经脱水剂去水分后，还要经过一种既能与脱水剂，又能与包埋剂相混合的溶剂—透明剂来处理，以便于包埋剂的深入或封藏。

在制片过程中有两次透明：第一次是组织块的透明，为了引入包埋剂。

第二次是染色以后切片的透明。

为了引入封藏剂。

（一）常用透明剂：透明剂都是石蜡的溶剂，绝大多数不能与水混合，最常用的透明剂有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，冬青油等。

1.二甲苯：目前应用最广。

易溶于乙醇，又能够溶解石蜡，加拿大树胶，透明力强，作用较快。

其最大缺点是容易变硬变脆.材料必须脱尽水分再透明，否则发生乳状浑浊。

在玻片进入二甲苯前，为了减少材料收缩，材料先经过1/2二甲苯+1/2无水乙醇→二甲苯（I）→二甲苯（II）→1/2二甲苯+1/2石蜡
材料在二甲苯中时间不宜过长，否则材料收缩变硬，变脆。

一般组织块透明总时间1-3小时，（每级30分钟左右）染色后的切片透明每级5-10分钟。