结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究
育苗室管理技术—组培过程中玻璃化引起的原因及防控方法
三、玻璃化的影响因素
1、材料的差异性的影响。 在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃
化合物的含量，使玻璃化比例下降。。
三、玻璃化的影响因素
7、通气性。 试管苗生长期间要求气体交换充分、良好。气体交换的好坏取决于生长量、养时间长则容易 导致玻璃化。
如何防止玻璃化？
四、玻璃化的预防措施
1、尽量选用玻璃化轻或者无玻璃化的材料；
2、降低细胞分裂素和赤霉素浓度。 适当增加培养基中无机盐的含量，降低铵钛氮浓度，提高硝态氮浓度；
四、玻璃化的预防措施
3、利用固体培养基 增加琼脂浓度，降低培养基水势，造成细胞吸水阻遏；
4、控制温度 适当降低温度，避免过高培养温度；
四、玻璃化的预防措施
5、增加自然光强 适当延长光照时间。实验发现，玻璃苗放在自然光下几天后，茎叶变红，玻
璃化逐渐减弱。因为自然光中有紫外线，能够加快木质化；
四、玻璃化的预防措施
三、玻璃化的影响因素
3、培养基成分的影响。 培养基中无机离子种类、浓度及其比例不适宜该种植物。
4、琼脂用量低。 培养基中琼脂含量低时，玻璃化苗比例增加，水渍状严重，苗只向上生长。
三、玻璃化的影响因素
5、温度要适宜。 过高、过低或者忽高忽低的温度都容易形成玻璃化苗。
6、光照。 光照不足加上高温很容易引起玻璃化，增加光照可促进光合作用，提高碳水
6、使用透气性好的封口材料。 如牛皮纸、棉塞、滤纸、封口纸等，尽可能降低培养容器内空气湿度，加强
植物试管苗玻璃化成因与预防措施的研究进展复习进程
植物试管苗玻璃化成因与预防措施的研究进展植物试管苗玻璃化成因及预防措施研究进展摘要：本综述主要阐述了组织培养中玻璃苗的成因，取材部位及外植体大小、光照、温度、封口材料、培养基的类型、植物激素等条件不适合都可能引起玻璃化现象。
并提出了相应预防措施, 为克服试管苗玻璃化提供有效的参考。
关键词：试管苗；玻璃化；成因；预防措施试管苗玻璃化是指在进行植物组织培养中, 试管苗生长异常, 叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状,芽苗矮小肿胀失绿,叶片皱缩成纵向卷伸,脆弱易碎[1]。
长期以来, 植物组织培养中存在三大亟待解决的问题——外植体污染、褐化和玻璃化现象, 这些因素严重阻碍了植物组培工作的进程。
因而，组织培养中玻璃苗的成因和各种防范措施应该引起了人们的广泛注意。
1 玻璃苗成因1.1 外植体材料与培养环境1.1.1 外植体选择培养植物的种类, 取材部位及外植体大小均会显著影响玻璃苗的发生。
学者在大叶相思外植体培养过程中发现, 幼叶叶片与顶芽更容易发生玻璃化, 当年生枝条在尚未木质化前取材培养, 几乎全部玻璃化, 外植体材料小于0.5cm 时易发生玻璃化。
这可能是外植体的较老组织中含有防止玻璃苗发生的物质, 或者是较大外植体的分生组织远离培养基表面, 而使其生长环境的水分状况得到改善[8]。
1.1.2 光照自然光照对玻璃化有抑制作用, 玻璃苗放于自然光照下几天后茎叶变红, 玻璃化逐渐消失, 因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟, 加快木质化[2]。
戴园园等分别用白光和蓝光对甜瓜试管玻璃苗进行了不同时长的处理,结果表明:不同的光和光强度对玻璃苗的发生都有影响, 在蓝光下,玻璃苗发生较为严重, 在白光下, 玻璃苗发生相对较少, 并且随着光照强度的增加玻璃苗发生的几率变小[3]。
孙满芝却认为, 光照时间太长会导致试管苗玻璃化率显著上升[4]。
因此对于光照是否对玻璃苗产生影响, 影响的程度有多大还没有统一的定论1.1.3 温度温度是植物生长的主要环境因子之一, 适宜组培苗生长的最适温度一般认为在24-26 °C,适当的低温处理有利于防止玻璃苗的形成,并可以使部分玻璃化后的苗转到正常生长状态, 通过变温处理, 加大昼夜温差,会使玻璃化现象消失[4]。
白花檵木组织培养玻璃化苗发生原因初探
白花檵木组织培养玻璃化苗发生原因初探作者：万涛来源：《现代园艺·下半月园林版》 2017年第4期在植物组织培养过程中，时常发生玻璃化的现象。
玻璃化苗的产生会影响植物培植效率。
为了保证植物的培植品质，本文将针对白花檵木组织培养玻璃化苗的产生进行试验设计，对其发生的各个影响因素进行简单分析，以此总结玻璃化苗的产生原因。
希望对我国植物工程培养提供借鉴。
1白花檵木组织培养玻璃化苗试验准备根据试验要求，事先准备好多株生长情况相同的试管苗，将一半的试管苗分为茎部、中部、根部等 4个部分，另一半放置在培养基内。
组织培养基内应添加不同影响物质，因此，需准备好不同浓度的 6-BA、聚乙烯醇、NAA、蔗糖等有机物。
2白花檵木组织培养玻璃化苗试验设计与原因分析2.1植物激素质量浓度的影响据有关资料显示，培养基中的细胞分裂素容易使玻璃化苗细胞快速分裂，促进其生长。
对于不同种类及不同浓度含量的分裂素，对玻璃化苗的影响不同。
BA的主要作用是促进芽的形成，在培养基内添加廉价又高效的 6-BA分裂素。
可以发现，随着其添加浓度的升高，增值系数与玻璃苗数量明显增高。
当 6-BA分裂素浓度为 0.5mg/L时，试管苗玻璃转化率最低为 3.3％，当 6-BA分裂素浓度达到 3.0mg/L时，玻璃转化率最高为 44.8％。
另外，培养基内生长素类物质的质量浓度也对白花檵木组织培养玻璃化苗产生不同的影响。
细胞生长素可以促进培养物细胞的分裂素浓度增高，进而改变玻璃转化率。
NAA是一种植物生长调节剂，同样能促进细胞分裂与扩大，加入不同浓度的人工合成激素 NAA，对白花檵木玻璃化苗发生情况进行测定，结果显示，随着 NAA质量浓度的升高，增值系数和玻璃化个数增加，当 NAA达到 1.5mg/L时，玻璃化率最高为 6.7％，验证了以上结论。
2.2合成纤维素含量的影响假设植物的合成激素与白花檵木组织培养玻璃化苗的产生率成正相关。
逐渐增高培养基内聚乙烯醇质量浓度，当聚乙烯醇质量浓度最高达到 21g/L时，玻璃化率反而最低为3.3％。
植物试管苗玻璃化成因与预防措施的研究进展
植物试管苗玻璃化成因及预防措施研究进展摘要：本综述主要阐述了组织培养中玻璃苗的成因，取材部位及外植体大小、光照、温度、封口材料、培养基的类型、植物激素等条件不适合都可能引起玻璃化现象。
并提出了相应预防措施,为克服试管苗玻璃化提供有效的参考。
关键词：试管苗；玻璃化；成因；预防措施试管苗玻璃化是指在进行植物组织培养中,试管苗生长异常,叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状,芽苗矮小肿胀失绿,叶片皱缩成纵向卷伸,脆弱易碎[1]。
长期以来,植物组织培养中存在三大亟待解决的问题——外植体污染、褐化和玻璃化现象,这些因素严重阻碍了植物组培工作的进程。
因而，组织培养中玻璃苗的成因和各种防范措施应该引起了人们的广泛注意。
1 玻璃苗成因1.1 外植体材料与培养环境1.1.1 外植体选择培养植物的种类,取材部位及外植体大小均会显著影响玻璃苗的发生。
学者在大叶相思外植体培养过程中发现,幼叶叶片与顶芽更容易发生玻璃化,当年生枝条在尚未木质化前取材培养,几乎全部玻璃化,外植体材料小于0.5cm时易发生玻璃化。
这可能是外植体的较老组织中含有防止玻璃苗发生的物质,或者是较大外植体的分生组织远离培养基表面,而使其生长环境的水分状况得到改善[8]。
1.1.2 光照自然光照对玻璃化有抑制作用,玻璃苗放于自然光照下几天后茎叶变红,玻璃化逐渐消失,因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟,加快木质化[2]。
戴园园等分别用白光和蓝光对甜瓜试管玻璃苗进行了不同时长的处理,结果表明:不同的光和光强度对玻璃苗的发生都有影响,在蓝光下,玻璃苗发生较为严重,在白光下,玻璃苗发生相对较少,并且随着光照强度的增加玻璃苗发生的几率变小[3]。
孙满芝却认为,光照时间太长会导致试管苗玻璃化率显著上升[4]。
因此对于光照是否对玻璃苗产生影响,影响的程度有多大还没有统一的定论。
1.1.3 温度温度是植物生长的主要环境因子之一,适宜组培苗生长的最适温度一般认为在24-26℃,适当的低温处理有利于防止玻璃苗的形成,并可以使部分玻璃化后的苗转到正常生长状态,通过变温处理,加大昼夜温差,会使玻璃化现象消失[4]。
结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究
首都师范大学学报(自然科学版)第22卷 第3期2001年9月Journal of Capital N ormal University(Natural Science Edition )V ol.22,N o.3Sept. 2001收稿日期:20002072073北京高技术实验室科研项目资助课题.结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究3成细华(首都师范大学生物系)刘 凡 曹鸣庆(北京市蔬菜研究中心)摘要 从培养基组份和培养条件两方面对结球白菜玻璃化的成因进行了研究.初步认为激素浓度和琼脂浓度是影响结球白菜玻璃化的主要原因.在一定范围内,降低BA 、NAA 浓度、提高琼脂浓度,不会影响芽的分化率,却有利于正常芽的分化形成;而改用通气性好的三角瓶或降低AgNO 3浓度,对抑制玻璃芽的发生无明显作用.关键词:结球白菜,玻璃化,组织培养.中图分类号:Q 945玻璃化是植物组织培养中特有的现象,它是影响不定芽生根和试管植株移栽成活的主要因素之一[1～3].各种内外因素,如材料种类,培养基成分和培养条件等都会影响玻璃芽的发生[5～6],但引起不同植物的玻璃化的主导因素各不相同.如甘蓝型油菜是由BA 浓度过高[2];毛白杨是相对湿度过高;石竹是琼脂、蔗糖浓度过低,且适当添加一定浓度的K NO 3,可以完全控制玻璃芽的发生[3];垂柳是铵离子浓度过高[1]等.导致试管苗玻璃化的原因还不太清楚,大多数人认为,试管苗玻璃化是内部失调的外在表现,也有人认为是形态结构上的玻璃化导致了功能上的障碍[1,4～6].叶绿素、蛋白质、木质素、酚、乙烯以及各种酶活性的变化究竟在玻璃苗的形成中起多大作用还不清楚.本研究对再生频率高的结球白菜80号玻璃芽的发生及克服途径进行了初步研究,旨在建立良好的再生体系,为以后利用该体系进行外源基因遗传转化作好准备.1 材料和方法111 实验材料本研究用再生频率高的结球白菜80号(北京市农林科学院蔬菜研究中心结球白菜育种课题组提供)为供试品种.以无菌实生苗子叶2子叶柄(带2mm 子叶柄的子叶)为外植体.112 培养方法种子用纱布包好,70%的酒精漂洗30s ;无菌水洗涤1次;215%次氯酸钠(V ΠV )溶液消毒10min ,不时摇动;无菌水洗涤3次;播种于100m L 三角瓶中(含25～30m L MS 基本培养基).3～4d 后切取子叶2子叶柄为外植体(以子叶张开变绿为准),接种于不同组份的分化培养基上,子叶柄插入培养基,分化生长两周后统计芽分化率;将带丛生芽的外植体转入MS 基本培养基,生长两周后统计出芽总数和芽玻璃化率.幼芽叶片增厚而狭长,叶表面缺少角质层,无正常茎尖为玻璃苗.所有培养均在2000lx 光照,光周期16h Π8h ,温度25±1℃的条件下进行.每一15×90mm 平皿含30～35m L 的分化培养基(pH518),以parafilm 封严;每一100m L 三角瓶含30m L 左右的分化培养基,三角瓶用通气性好的封口膜封口.外植体放置密度为:10～15个Π皿,5个Π三角瓶.每次实验重复3次,每次10～30个外植体.2 结果和分析211 激素浓度对成苗的影响表1 激素浓度对成苗的影响BA Πmg L -1NAA Πmg L -1外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%21001100470198193411167154210001503601941433197521292100011045015027016051581100015072019720121794313611000110360133901257160 分化培养基:MS +AgNO 33mg L -1+110%琼脂+不同的激素浓度配比BA 浓度在2～1mg L-1,NAA 在1～015mg L -1之间,芽分化频率都在90%以上.在这个浓度范围内,随着外源激素浓度的降低,平均每个外植体产生的芽数减少,但玻璃化程度减轻,从67154%降至43136%.当外源激素进一步降低时,虽然玻璃化程度进一步降低,但是同时芽分化率也明显降低,因此外源激素不能降得太低.以上数据表明,在结球白菜再生中,BA 、NAA 浓度高时更容易刺激芽的发生,但浓度过高会影起分化芽内内源激素水平失调而使芽玻璃化.212 琼脂浓度对成苗的影响表2 琼脂浓度对成苗的影响琼脂浓度Π%外植体芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%018440186137311193137110720197201217943137114410190751183111311639012815013826147 分化培养基:MS +BA 1mg L -1+NAA 015mg L -1+AgNO 33mg L -1+不同浓度琼脂培养基中的琼脂浓度,影响培养基中可利用水分及容器内的相对湿度.从表2可知,在一定范围内提高琼脂浓度,可减少结球白菜再生过程中玻璃苗的形成.当琼脂浓度为018%时,在几乎无正常苗的形成.当琼脂浓度提高到114%时,外植体芽发生率在90%以上,芽玻璃化程度却明显减轻.但当琼脂浓度进一步提高到116%时,不利于芽的分化,且玻璃化程度比琼55第3期成细华等:结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究65首都师范大学学报(自然科学版)2001年脂浓度为114%高,可能是因为琼脂浓度太高,培养基变得很硬,营养物质和激素很难被培养的组织吸收,因而影响了芽的分化和发育.213 容器对成苗的影响表3 容器对成苗的影响容器外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%平皿a720197201217943137三角瓶a30019685218344109平皿b470198193411167154三角瓶b300197131413568190 a—分化培养基为MS+BA1mg L-1+NAA015mg L-1+AgNO33mg L-1+110%琼脂b—分化培养基为MS+BA2mg L-1+NAA1mg L-1+AgNO33mg L-1+110%琼脂由表3知,培养容器不同不是影响结球白菜玻璃化的主要原因.用两种分化培养基,同时将子叶2子叶柄均匀接种于平皿和三角瓶中,在2000lx,16hΠ8h培养两星期,相对于同一种培养基,培养皿和三角瓶中外植体形成愈伤时间、大小及产生芽的时间基本一致,芽的玻璃化程度相差不大.将带丛生芽的外植体转于MS基本培养基上生长两周,统计发现,出芽总数和芽的玻璃化率只跟激素组成有关,而与培养容器无关.214 AgN O3对成苗的影响表4 AgN O3对成苗的影响AgNO3浓度Πmg L-1外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π% 1100340176581171371632100420180801190401153100720197201218343137 分化培养基:MS+BA1mg L-1+NAA015mg L-1+110%琼脂+不同浓度的AgNO3在芸薹属作物的再生过程中,常添加AgNO3来抑制乙烯的作用,促进芽的发生.由表4可浓度为1～3mg L-1时,芽分化率上升,每个外植体产生的芽数也增多,但对芽以看出,当AgNO3的玻璃化程度影响很小.3 讨 论本实验发现,激素浓度和琼脂浓度对结球白菜玻璃苗发生均有一定的影响,而降低AgNO3浓度或改用通气性好的三角瓶,对结球白菜玻璃苗形成影响不显著.朱青松在烟草髓的再生研究中发现,培养基中的BA和NAA高皆引起分化芽的玻璃化,他认为,外源激素水平影响着内源I AA的含量,从而影响分化芽的状态[8].本实验通过降低BA 和NAA两者的浓度,降低了结球白菜组织培养中玻璃苗的形成.植物细胞在体外培养过程中会产生乙烯,尤其在密闭的容器中,乙烯通过累积会达到一个过高的浓度,影响植物的生长发育.Chi认为,在B.campestris的再生中,高水平的乙烯易引起的有无,琼脂浓度的高低,影响着容器芽分化率降低,导致再生芽生长发育的玻璃化[8].AgNO3中乙烯的含量[9,10].张凤兰在对结球白菜的研究中发现,琼脂浓度越高,乙烯产生量越少,当培养基的琼脂浓度达到116%时,得到的芽发生率高,且平均每个外植体得到的芽也多.本研究所得结果与此不太一致.当琼脂浓度在018%～114%范围内,随着琼脂浓度的提高,芽分化率变化很小,芽的玻璃化率却显著降低.但当琼脂浓度升至116%时,芽分化率迅速降低.分析其原因,可能是因为琼脂浓度太高,培养基变得很硬,营养物质和激素很难扩散到培养的组织中去[11].AgNO 3同时增加了芽分化能力和乙烯产量[9],因此推测AgNO 3是通过Ag +竞争性地与乙烯在膜上的受体相结合而抑制乙烯的作用[9～11].张松认为,当AgNO 3含量高于12mg ΠL 时,对结球白菜芽分化产生抑制作用,出芽率下降,且易产生畸形苗[12].本实验在AgNO 3浓度不超过3mg ΠL 的情况下,没有观察到AgNO 3浓度的变化对结球白菜玻璃芽产生的影响.在外植体再生建立过程中,往往由于外植体产生的致死性褐化物而使实验失败.为了防止褐变和有害物质的积累,常在培养基中加入活性炭(AC )以吸收有害物,降低其不利影响[13].王家旺在培养基中加入013%的AC 降低了油菜茎尖培养过程玻璃芽的产生[13].本实验中,在分化培养基中加入110%的AC ,只有子叶的膨大,没有芽的分化,可能是AC 在吸收有害物的同时,也吸附了生长调节物质和其它培养基成分[13].在培养基中添加不同浓度的蔗糖(3%、6%、9%),观察其对玻璃芽形成的影响.实验发现,随着蔗糖浓度的增高,不但不能抑制玻璃芽的发生,反而明显抑制不定芽的分化.这与胡开林在青花菜组培再生上的研究结果一致[14].这说明提高培养基的渗透压不能有效地抑制玻璃芽的发生.参考文献1 卜学贤,陈维伦.试管植物的玻璃化现象.植物生理学通讯,1987,23(5):13～192 程振东,卫志明,许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生.植物学报,1994,36(9):657～6633 刘非燕,郭达初.重瓣丝石竹试管苗玻璃化发生原因初探.杭州大学学报,1996,23(4):282～2874 张洪胜,牟云官,辛培刚.苹果离体培养中试管苗玻璃化现象发生机理探讨.林业科学,1992,17(3):10～125 Bottcher C H ,V ogelmann T C.E ffect of righdity of gel medium on benzyladenine 2induced adventitious bud forma 2tion and vitrification in Picea abies .Physiology Plant ,1984,61:505～5126 Z im M ,Meir G,Harlevy A.Factors in fluencing the production of harded glaucous Carnation plantlets in vitro.PlantCell ,T issue and Organ culture ,1982,2(1):55～657 Leshem B ,Shaley D P ,I zhar S.The effect of cytokinins on vitrification in melon and carnation.Annals of Botany ,1988,62(2):272～2768 朱青松,梅康凤,王沙生.外源生长素对烟草髓愈伤组织分化和内源I AA 含量的影响.北京林业大学学报,1999,21(1):22～259 Chi GL ,Pua E C ,G oh C J ,et al .R ole of ethylene on de novo shoot regeneration from cotyledon explants of Bassi 2Bca campestris ssp.pekinensis (Lour )Olss on in vitro .Plant Physiol ,1991,96:17010 F L Zhang ,Y T akahata ,J B Xu.Medium and genotype factors in fluencing shoot regeneration from cotyledonaryexplants of Chinese cabbage (Brassica campesstris L.ssp.pekinensis ).Plant Cell Reports ,1998,17:780～78611 张鹏.硝酸银和脱落酸相配合影响菜心离体培养之植株再生方式的组织学研究.热带亚热带植物学报,1996,4(1):7112 张松,魏毓棠,等.利用乙烯抑制剂AgNO 3建立结球白菜高频植株再生体系.园艺学报,1997,24(1):94～96(下转第64页)75第3期成细华等:结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究46首都师范大学学报(自然科学版)2001年Alien G enes T ransferred to Wheat ThroughI nduced T ranslocationHu Y ingkao(Department of Biology,Capital N ormal University)AbstractThe acheivement of alien genes trans ferred to wheat through induced translocation was reviewed. Alien gene res ources used to trans fer and methods of producing translocation were introduced.Transloca2 tion line induced methods and gene res ources were analysed.The perspective was als o given in the paper.K ey w ords:wheat,alien gene,translocation line(上接第57页)13 刘用生,李友勇.植物组织培养中活性炭的使用.植物生理学通讯,1994,30(3):214～2114 胡开林,杨瑞还.青菜花试管苗玻璃化发生及克服途径的初步研究.华南农业大学学报,1998,19(4):63～66Vitrification of R egeneration Shoots of Chinese C abbageCheng X ihua(Department of Biology,Capital N ormal University)Liu Fan Cao Mingqing(Beijing Vegetable Reseach Center)AbstractMedium gradient and culture conditions in plant tissue culture of Chinese cabbage were studied.The vitrification of regeneration shoots of Chinese cabbage in vitro was m ostly affected by horm ones concentra2 tion and agar concent.T o s ome certain,the normal shoot regeneration was facilitated by decreasing hor2 m one concentration of increasing agar concentration.But there is no evident effect for inhibiting the occur2 rence of vitreous shoot by decreasing AgNO3concentration or changing culture dishes into culture flasks.K ey w ords:Chinese cabbage,vitrification,thssue culture。
一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法[发明专利]
![一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8d55c313770bf78a6429545c.png)
专利名称：一种利用大白菜球叶获得再生植株的培养方法专利类型：发明专利
发明人：刘倩倩,刘维信
申请号：CN201410364506.0
申请日：20140729
公开号：CN104115751A
公开日：
20141029
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种取材便利、成本低、重复性好以及无畸形芽的利用大白菜球叶叶片获得再生植株的方法。
其特征包括以下步骤：(1)选取结球期大白菜外部球叶，在无菌条件下消毒灭菌。
(2)将灭菌后的叶片正面向上平置于芽诱导培养基上进行培养。
(3)外植体在芽诱导培养基中培养28d后，转入MS基本培养基中继续培养。
将外植体上长度大于1.5cm的再生不定芽切下，转入生根培养基诱导生根。
(4)再生芽基部形成大量毛根后，将再生苗根部的生根培养基洗净，栽入盛有固体基质的塑料花盆中。
本方法直接从田间生长植株取材，不需要经过种子萌发过程，对及时保存优良珍贵大白菜材料意义重大，同时为大白菜转基因育种研究提供稳定的受体新材料。
申请人：青岛农业大学
地址：266000 山东省青岛市城阳区长城路700号
国籍：CN
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组培苗的玻璃化问题
组培苗的玻璃化问题日期：2010 年4 月1 日来源：互联网作者：植物组培网点击：3026在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh （1981 ）首先命名的“玻璃化”（Vitrification ）。
是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。
玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。
植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50% 以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。
（一）玻璃苗发生的因素琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。
Daniel G. W. Brown 认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。
碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury 等）。
随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。
Debergh 等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv 等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。
刘思颖等（1988 ）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的 1.9 倍，含水量为正常苗的 2.09 倍—2.21 倍。
自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。
植物组培技术常见问题及其预防措施
植物组培技术常见问题及其预防措施摘要主要对植物组培技术中常见问题如污染、材料褐变和玻璃化现象等方面进行阐述，并在此基础上提出相应对策。
关键词植物组织培养技术；常见问题；预防措施中图分类号：S722 文献标志码：B 文章编号：1673-890X （2015）36-0-02植物组织培养技术作为当代生物科学中最有生命力的一门学科，应用广泛，在农业、林业、工业和医药业等行业均有涉及，且产生了巨大的经济和社会效益，但由于组培育苗操作程序复杂，各种技术难题仍受到广大科研工作者的困扰，如污染、材料褐变、瓶苗玻璃化等常见问题屡见不鲜，试验组培成功的植物多样，但利用组培规模化生产的植物并不多见，下面对该技术中常见的三大问题（污染、材料褐变和玻璃化现象）及预防措施进行阐述[1-4]。
1 污染问题1.1 污染原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。
在实验室及规模化生产中，组织培养中污染时有发生，造成污染的原因主要有以下几点：培养基以及在培养过程中的各种器具灭菌不彻底；培养时外植体消毒不彻底；接种和培养环境不清洁；接种人员无菌操作不严格；培养容器原因，包括盖子和封口膜等。
此外，材料灭菌不彻底同样也会造成成批接种材料被细菌污染，而且培养过程不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。
培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染[5-9]。
1.2 污染的预防措施1.2.1 灭菌彻底严格各个环节的操作流程，特别是培养基及操作过程中的各种器具必须要严格灭菌。
培养基灭菌有以下要求：耐高温培养基在121～123 ℃条件下灭菌20～30 min。
其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。
最后，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗[10-14]。
结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究
结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究（实用版3篇）篇1 目录1.引言2.实验材料和方法3.结果与分析4.结论篇1正文结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究1.引言结球白菜是我国北方地区的一种重要蔬菜，具有高产、抗病、品质好等特点。
近年来，随着人们对健康饮食的追求，对蔬菜的品质、产量和抗病性等提出了更高的要求。
植物组织培养技术作为一种高效、快速繁殖优良品种的方法，在蔬菜育种中发挥着重要作用。
本研究旨在探讨结球白菜子叶高效离体不定芽再生的条件，为高效繁殖结球白菜优良品种提供技术支持。
2.实验材料和方法2.1 实验材料实验材料主要包括结球白菜种子、MS 培养基、激素（包括细胞分裂素和生长素）、无菌设备和培养箱等。
2.2 实验方法将结球白菜种子在无菌条件下消毒，然后接种在 MS 培养基上，添加适当浓度的细胞分裂素和生长素。
将培养基放入培养箱中，保持温度为20-25℃，光照时间为 12 小时/天。
每隔 7 天观察子叶再生情况，统计每个培养皿中再生芽的数量。
3.结果与分析通过实验发现，结球白菜子叶在适当的激素浓度和培养条件下，可以高效地再生不定芽。
在不同激素浓度下，子叶再生芽的数量有所不同。
当细胞分裂素与生长素的比值为 1:1 时，子叶再生芽的数量最多。
在继续培养的过程中，再生芽逐渐分化成完整的植株。
4.结论本研究结果表明，在适当的激素浓度和培养条件下，结球白菜子叶可以高效地再生不定芽。
为实现结球白菜优良品种的高效繁殖，需要进一步优化培养条件和激素浓度，提高再生芽的数量和质量。
篇2 目录1.引言2.实验材料和方法3.结果与分析4.结论篇2正文结球白菜（学名：Brassica rapa L.var.capitata L.）是一种重要的蔬菜作物，具有较高的营养价值和良好的保健功能。
为了提高结球白菜的繁殖效率，本研究以结球白菜子叶为外植体，探讨了高效离体子叶不定芽再生的方法。
1.实验材料和方法1.1 实验材料：新鲜的结球白菜子叶、无菌培养基、植物激素、移液器、培养箱等。
植物组培中玻璃化现象及其预防措施
低 的浓度 ， 如非 洲 菊 只有 在 Ｂ ～ ０ ／ 才能 诱 Ａ ２ １ｍｇ Ｌ时 导 幼 花托 脱 分化形 成 愈 伤组 织 ， 在愈 伤 组 织上 诱 并
导不 定芽 ；而在丛 生 芽增 殖过 程 中 ， Ａ １ ／ Ｂ ｍｇ Ｌ即可
１ 玻璃化苗 的特 点与发 生原 因
ＮＨ ＋ ４水平 的 Ｂ ５培 养基 。 （ ） 加 自然光 照 ， 照 强度 较 弱 时 ， ６增 光 可通 过 延 长 时 间进行 补偿 。
的 消毒 和清 洗后很 容 易水渍 状 ， 继而 产生 玻璃 化 。
２５ 光 照 时 间 ．
光 照影 响 光合 作 用 和碳 水 化 合 物 的合 成 ， 照 光
普遍 。
２ 影 响玻 璃 化 苗产 生 的 因素
２１ 生长调 节剂 ．
正常 的比例很 低 ， 继代 培养 中仍 然形成 玻璃 苗 ， 玻 且 璃苗 的分化 能 力低 下 ， 以增 殖 生 根成 苗 。由于 玻 难 璃苗 的生 理功 能异 常 ， 以移栽 成活 ， 难 因此 玻璃苗 的
试 管苗 玻璃 化研究 的重 点 。■
信 资 息 讯
鬻 ０
杭州 农业科学研霪陀 验． 获得食晶检验机构资质 １ ，
日前 ， 州 市农 科 院 实验 中心通 过 省 级计 量 认 证 复评 审 和 扩项 评 审 ， 杭 同时获 得 食 品
检验 机构 资 质认 定证 书 ，获 准 的检测 项 目由原 来 的 １５项 扩 展 到 ２０项 ，覆 盖 土壤 、 ６ ７ 水 质、 空气 、 品 、 食 植物 性食 品 、 物源 性食 品 、 产 品 、 叶 、 料等领 域 。 动 水 茶 饲 至此 ， 州市 农 科 院 实验 中心 已有 中 国合 格 评 定 国家 认 可 委实 验 室认 可 、 江 省计 杭 浙 量认 证 、 业 部农 产 品质 量安 全检 测机 构 、 品检 验机 构 等 四项 资质 。为 更好 的服 务 “ 农 食 三 农 ”提高杭 州 市农产 品质量安 全水 平作 贡献 。 、
试管苗玻璃化现象的研究进展
试管苗玻璃化现象的研究进展作者：高弘扬许丹芸周良云来源：《现代农业科技》2019年第20期摘要 ; ;玻璃化是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，普遍发生于多种植物中。
玻璃化试管苗呈透明或半透明的水浸状，叶片卷曲畸形，分化及存活能力低，无法进行继代培养及驯化移栽，给种苗商业化生产造成了严重的经济损失，也限制了组织培养技术在种质资源保存及基因工程育种中的应用。
目前，对玻璃化发生的机制尚没有统一的认识。
本文对玻璃化现象、发生机制以及预防措施等相关研究进行了综述，以期为研究玻璃化发生发展的机制并开发有效的防控措施提供借鉴。
关键词 ; ;植株组织培养;试管苗;玻璃化;发生机制;防控措施中图分类号 ; ;S604 ; ; ; ;文献标识码 ; ;A文章编号 ; 1007-5739（2019）20-0052-05 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 开放科学（资源服务）标识码（OSID）Abstract ; ;Hyperhydricity（HH）is a physiological disorder and morphological malformation owing to stresses related to in vitro culture conditions，which often occurs in plant tissue culture. Hyperhydric plantlets show a typical glassy or vitrescent appearance，which is characterized by thick，translucent，curled，and brittle leaves. These plantlets survive very poorly when they are subcultured in fresh medium or transferred to an ex vitro environment. It can cause considerable losses in commercial micropropagation industry by reducing the quality and multiplication rate of the cultured plants. It also limits the application of tissue culture methods to the conservation of plant resources and genetic transformation of plants. Up to now，the molecular mechanism of HH is not yet clear.In this paper，research progress on the phenomena，mechanism and preventive measures of hyperhydricity were reviewed，in order to provide references for the study of the mechanism of hyperhydricity and the development of effective preventive and control measures.Key words ; ;plant tissue culture;tube seedling;hyperhydricity;mechanism;control measure組织培养技术可短时间内快速地生产大量无菌苗，当前已经被广泛应用于植物脱毒、育种和快速繁殖。
植物材料 组培 玻璃化
植物材料玻璃化玻璃化苗外形与正常苗有显著差异。
其叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。
由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全；分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。
玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。
试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。
产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。
1.激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高)，易导致玻璃化苗的产生。
产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。
细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现为茎节较短、分枝较多的特点。
使细胞分裂素增多的原因有以下几种：一是培养基中一次性加入过多细胞分裂素，比如6—BA、ZT等；二是细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素含量远远高于生长素，而使植物过多吸收细胞分裂素，体内激素比例严重失调，试管苗无法正常生长，而导致玻璃化；三是在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内累积过量的细胞分裂素。
在初级培养相同的培养基，最初的几代玻璃化现象很少，多次继代培养后，便开始出现玻璃化现象，通常是继代次数越多玻璃化苗的比例越大。
2.琼脂浓度培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。
随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。
因此，琼脂的浓度一定要适当。
3.温度适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。
温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。
4.光照时间不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。
结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究的开题报告
结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究的开题报告前言随着社会经济的发展以及人们生活水平的提高，白菜等蔬菜作物的需求量逐年增长。
然而，作物生长期间面临着气温、湿度、盐碱度等多种环境胁迫，导致产量下降和品质变差。
因此，如何提高白菜抗逆性能已成为蔬菜栽培中急需解决的问题。
本研究将探究结球白菜抗逆基因遗传转化方法，以期提高其抗逆性能，降低其环境胁迫下的产量损失。
一、研究背景白菜作为重要的蔬菜之一，在我国栽培历史悠久，且味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱。
然而，作为一种非耐逆性蔬菜作物，白菜在种植过程中面临着气温、湿度、盐碱度等多种环境胁迫，导致产量下降和品质变差。
当前，为了提高作物的产量和质量，许多科学家都在探索利用基因工程技术来吸纳优异基因，从而改善作物生长环境的变异性。
然而，自然基因突变和重组是不可预测的，许多常规转基因作物对于环境因素的调节能力也存在不少局限性。
因此，如何提高作物的抵御环境胁迫的能力，降低环境因素下作物的生产损失，是种植业面临的一个重要问题。
本研究拟以结球白菜为对象，运用基因编辑技术和生物技术手段，探究结球白菜抗逆基因遗传转化方法，以期提高结球白菜的抗逆性能，降低环境因素下的生产损失。
二、研究目的和意义通过对结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究，可以探索结球白菜在遗传水平上的适应性，提高其抗逆性能，降低环境因素下的生产损失。
具体的研究目的和意义如下：1. 探索结球白菜抗逆基因转化方法，为蔬菜栽培提供技术支持。
2. 通过基因编辑技术，吸纳抗逆基因，提高结球白菜在极端环境下的生存能力和产量。
3. 为蔬菜生产提供新的种植策略，促进蔬菜行业的可持续发展。
三、研究内容和方法1. 结球白菜抗逆基因筛选初步筛选抗逆基因并鉴定其作用机制。
依据白菜抗逆生理特点设计抗逆表型筛选程序，采用标准环境和模拟环境对抗逆性强的品种进行SDS-PAGE蛋白质组分析、RNA-seq分析等，发现与抗逆性相关的代表性蛋白质及其基因，进一步验证其在抗逆性中的作用。
亚龙组培分享组培商业生产中的常见问题之三 (组培苗玻璃化问题)
组培商业生产中的常见问题之三（组培苗玻璃化问题）让我们继续关注组培商业化生产常见问题之玻璃化现象，在进行组培过程中，经常会发现培养苗或试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩呈纵向卷曲、脆弱易碎；叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织，这种试管苗生长异常的现象我们称之为“玻璃化”。
玻璃化苗因其体内含水灵高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，其角质层、栅栏组织发育不健全，表现为光合能力差，酶活性能力低，组织畸形、分化能力降低等现象，所以很难继续用作组培继代培养和扩大繁殖的材料，后期生根困难，移栽后也很难成活，这也是困扰组培工厂化运作的关键环节；玻璃苗达到50%以上，严重影响繁殖率的提高，后期危害相当严重，也是丞待解决的问题。
一、玻璃苗发生的因素（1）激素浓度激素的影响包括生长素和分裂素，一方面指细胞分裂素的浓度，另一方面只以上两种激素的比列平衡，高浓度的分裂素有助于芽的分化，也会使玻璃化的发生比列提高，每种作物发生玻璃化的激素水平都不相同，有的品种在BA0.5mg/l时就有玻璃化发生。
许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高玻璃苗的比例越大。
（2）培养基琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂和糖浓度越高，玻璃苗的比例越低，碳源不仅为芽的形成提供能量，而且可以起渗透调节作用，主要影响培养基的渗透势，随着琼脂浓度及纯度的增加，培养基的硬度也增加，从而影响其衬质势和水分状况，虽然培养基硬度增加，玻璃化比例明显减少，但过多时培养基太硬，不利于植物体对养分的吸收，使苗生长速度减慢。
（3）培养条件温度主要影响苗的生长速度，温度升高时，苗的生长速度明显加快，高温达到一定限度后，会对正常的生长和代谢产生不良影响，促进玻璃化的产生，变温培养时温度变化幅度大，忽高忽低的温度变化容易产生内壁水滴，会增加内部湿度，降低容器的透光率，提高玻璃苗的发生率。
如何克服植物组织培养中试管苗玻璃化问题
如何克服植物组织培养中试管苗玻璃化问题
刘淑玉;祁东文;冯文伟
【期刊名称】《新疆林业》
【年(卷),期】2001(000)001
【摘要】@@ 在进行植物组织培养时,经常会出现"玻璃苗",即试管苗生长异常,叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状;整株矮小肿胀,失绿;叶片皱缩成纵向卷伸,脆弱易碎.
这种"玻璃苗"是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变,很难继续用
作继代培养和扩繁材料,生根困难,移栽后也很难成活.它已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍,是进行组培工作的一大难题.为解决这一问题,我们经过多年的观察,查阅资料,采取了以下几项措施,使试管苗玻璃化现象基本得到了有效控制.
【总页数】1页(P15)
【作者】刘淑玉;祁东文;冯文伟
【作者单位】阿克苏地区林科所;阿克苏地区林科所;阿克苏地区林科所
【正文语种】中文
【相关文献】
1.青花菜试管苗玻璃化发生及克服途径的初步研究 [J], 胡开林;杨瑞环
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文军;任苓;王劲松
5.影响樱桃试管苗玻璃化的因素与克服措施 [J], 贾海慧
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组培苗的玻璃化问题
组培苗的玻璃化问题日期：2010年4月1日来源：互联网作者：植物组培网点击：3026在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。
是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。
玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。
植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。
（一）玻璃苗发生的因素琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。
Daniel G. W. Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。
碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。
随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。
Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。
刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。
自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。
Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。
植物组织培养中玻璃化问题的研究进展
摘要：综述了组织培养中易出现玻璃化苗的植物种类、玻璃苗的形态解剖特征、生理生化特征、玻璃苗的成因以及防治玻璃苗形成的措施等。
易出现玻璃化的植物种达80多种，其中草本植物多于木本植物。
玻璃苗的组织含水量明显高于正常苗；糖代谢发生障碍，降解加快，利用滞缓；蛋白质含量及酶活性降低，叶绿素含量显著低于正常苗。
取材部位及外植体大小、光照、温度、封口材料、培养基的类型、植物激素等条件不适合都可能引起玻璃化现象。
提出了相应预防措施，为克服试管苗玻璃化提供有效的参考。
关键词：组织培养；试管苗；玻璃化；生理生化；培养环境长期以来，植物组织培养中存在三大亟待解决的问题——外植体污染、褐化和玻璃化现象，这些因素严重阻碍了植物组培工作的进程。
作为三大问题之一的玻璃化现象自从20世纪60年代就受到了关注，Phillips、Hackett等最早描述了石竹茎尖培养时所出现的半透明的异常试管苗现象[1-2]。
对玻璃化现象进行系统而又全面的研究是在1981年，Debergh等明确提出了试管植物“玻璃化作用”（vitrification）这一概念。
从此，组织培养中玻璃苗的成因和各种防范措施引起了人们的广泛注意。
“试管苗玻璃化”是指在进行植物组织培养中，试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎。
这些试管苗在培养过程中发生了一种生理失调或生理病变，表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。
目前，在对许多植物进行微体繁殖的过程中，玻璃苗或多或少都会发生，出现率达到100% 。
本文在查阅国内外有关试管培养材料玻璃化的形成机理，诱发因素和防治措施等多个方面的基础上，结合自己的研究，提出了相关的看法，以期与同行们商榷。
1 易出现玻璃化现象的试管苗植物在组织培养过程中，试管苗的玻璃化现象普遍存在，草本与木本植物中均有发生，目前已报道出现玻璃化苗的植物达80多种，草本玻璃化植物多于木本植物。
结球白菜高效离体子叶不定芽再生的研究
平均每子叶再生不定芽数
Average number of shoot regeneration per exp lant C1 0 a 0 a 113 b 110 b 115 b 211 c 314 f 312 f 215 cd 216 cde 219 def 311 ef C2 0 a 0 a 0 a 0 a 114 b 116 b 313 e 311 de 213 c 216 cd 218 cd 217 cd
结球白菜 (B rassica cam pestris ssp. pek inensis ( L. ) O lsson ) 是我国最重要的蔬菜作物之一 。目前 , 为了进一步提高结球白菜的品质 、抗病虫性和抗逆性等 , 采用基因工程将目的基因导入结球白菜 , 在保 持其原有优良性状的基础上改良结球白菜的遗传特性 , 为结球白菜遗传育种提供了新技术 。但是基因工 [1] 程技术的应用要求高效的不定芽再生系统 , 而结球白菜属于芸苔属 , 是离体不定芽再生困难型植物 。 近年来 , 国内外学者已作了许多尝试来提高白菜类的离体不定芽再生率 , 但多数报道中不定芽再生率都 很低 , 且材料专一性强 , 使得基因工程技术的应用受到限制
1 12 方法
将种子在 75%乙醇中表面消毒 30 s后 , 再用 011%的 HgC l2 溶液消毒 10 m in, 用无菌水冲洗 5 次 。 将消毒好的种子在无菌滤纸上吸干水后 , 接种在含 1 /2 M S培养基的培养皿中 , 每皿 (直径 9 cm ) 20 粒 ,
收稿日期 : 2004 02 23 基金项目 : 教育部留学回国人员科研启动基金资助项目 ( [ 2001 ] 498)
激素 /
mg・L - 1 Hormone NAA + 6 2 BA 011 + 110 011 + 310 011 + 510 011 + 710 015 + 110 015 + 310 015 + 510 015 + 710 110 + 110 110 + 310 110 + 510 110 + 710
植物组培过程中玻璃化问题的探讨
培养基成分
３．２．１无机盐和离子的影响多数研究表明，ＭＳ培养基是 防止玻璃化发生较理想的培养基．培养基中增加Ｋ，Ｐ，Ｆｅ， Ｃｕ，Ｍｎ，Ｚｎ元素的含量，降低Ｂ含量，增加硝态氮，降低铵态 氮，均可避免玻璃苗发生．培养基中的ＮＨ４＋过多容易导致试 管苗玻璃化发生．张翠玉等拉纠在ＭＳ培养基中减少３／４的 ＮＨ。ＮＯ，或除去ＮＨ。ＮＯ，对减少月季玻璃化苗的产生，效果 极显著，月季品种“杨基歌”和“黄和平”在完全除去ＮＨ” ４ＮＯ，的培养基上未出现玻璃茁． ３．２．２碳源与植物激素的影响糖作为碳源，除为细胞提 供合成新化合物的碳骨架的能源外，还可以维持一定的渗透 压．在ＭＳ培养基中，糖浓度与玻璃苗发生率呈极显著负相关
植物组织培养中，常常可以观察到分化形成一些半透明 状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗”．在离体培 养中，再生植株成长为“玻璃莳”的现象称为“玻璃化现象 （ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”…．现已发现，玻璃化现象在组织培养中普遍 存在，很多草本和木本植物的组培苗均有玻璃化现象‘２Ｊ，在 草本和木本植物中已有报道出现玻璃化苗的植物达７０多 种ｐＪ．由于玻璃莳的组织结构和生理功能异常，难以分化、增 殖、生根、移栽成活，已成为组培工作中亟待解决的一大难 题．自从ＰｈｉＩＩｉｐｓ等描述了石竹茎尖培养时所出现的半透明 状态异常试管苗现象，及年Ｄｅｂｅｒｇｈ等（１９８１）”ｏ首次进行系 统研究并提出“玻璃化”一词以来，组织培养中玻璃苗形成的 机理和预防措施一直受到组培工作者的广泛关注．国内外学 者已对玻璃苗的有关内容”“ｏ进行了研究并取得了一定的 成绩，ｆ日还不够系统深入．本文将针对其形态解剖结构、生理 生化特点、形成的机理、导致的因素及其预防措施进行综述．
失，细胞质变薄，细胞核解体．这些形态解剖学特点的研究。 不仅使从形态Ｅ判定玻璃苗更为准确，还使从细胞学水平上 判定早期未发生形态变化的玻璃苗成为吖能．
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首都师范大学学报(自然科学版)第22卷 第3期2001年9月Journal of Capital N ormal University(Natural Science Edition )V ol.22,N o.3Sept. 2001收稿日期:20002072073北京高技术实验室科研项目资助课题.结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究3成细华(首都师范大学生物系)刘 凡 曹鸣庆(北京市蔬菜研究中心)摘要 从培养基组份和培养条件两方面对结球白菜玻璃化的成因进行了研究.初步认为激素浓度和琼脂浓度是影响结球白菜玻璃化的主要原因.在一定范围内,降低BA 、NAA 浓度、提高琼脂浓度,不会影响芽的分化率,却有利于正常芽的分化形成;而改用通气性好的三角瓶或降低AgNO 3浓度,对抑制玻璃芽的发生无明显作用.关键词:结球白菜,玻璃化,组织培养.中图分类号:Q 945玻璃化是植物组织培养中特有的现象,它是影响不定芽生根和试管植株移栽成活的主要因素之一[1～3].各种内外因素,如材料种类,培养基成分和培养条件等都会影响玻璃芽的发生[5～6],但引起不同植物的玻璃化的主导因素各不相同.如甘蓝型油菜是由BA 浓度过高[2];毛白杨是相对湿度过高;石竹是琼脂、蔗糖浓度过低,且适当添加一定浓度的K NO 3,可以完全控制玻璃芽的发生[3];垂柳是铵离子浓度过高[1]等.导致试管苗玻璃化的原因还不太清楚,大多数人认为,试管苗玻璃化是内部失调的外在表现,也有人认为是形态结构上的玻璃化导致了功能上的障碍[1,4～6].叶绿素、蛋白质、木质素、酚、乙烯以及各种酶活性的变化究竟在玻璃苗的形成中起多大作用还不清楚.本研究对再生频率高的结球白菜80号玻璃芽的发生及克服途径进行了初步研究,旨在建立良好的再生体系,为以后利用该体系进行外源基因遗传转化作好准备.1 材料和方法111 实验材料本研究用再生频率高的结球白菜80号(北京市农林科学院蔬菜研究中心结球白菜育种课题组提供)为供试品种.以无菌实生苗子叶2子叶柄(带2mm 子叶柄的子叶)为外植体.112 培养方法种子用纱布包好,70%的酒精漂洗30s ;无菌水洗涤1次;215%次氯酸钠(V ΠV )溶液消毒10min ,不时摇动;无菌水洗涤3次;播种于100m L 三角瓶中(含25～30m L MS 基本培养基).3～4d 后切取子叶2子叶柄为外植体(以子叶张开变绿为准),接种于不同组份的分化培养基上,子叶柄插入培养基,分化生长两周后统计芽分化率;将带丛生芽的外植体转入MS 基本培养基,生长两周后统计出芽总数和芽玻璃化率.幼芽叶片增厚而狭长,叶表面缺少角质层,无正常茎尖为玻璃苗.所有培养均在2000lx 光照,光周期16h Π8h ,温度25±1℃的条件下进行.每一15×90mm 平皿含30～35m L 的分化培养基(pH518),以parafilm 封严;每一100m L 三角瓶含30m L 左右的分化培养基,三角瓶用通气性好的封口膜封口.外植体放置密度为:10～15个Π皿,5个Π三角瓶.每次实验重复3次,每次10～30个外植体.2 结果和分析211 激素浓度对成苗的影响表1 激素浓度对成苗的影响BA Πmg L -1NAA Πmg L -1外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%21001100470198193411167154210001503601941433197521292100011045015027016051581100015072019720121794313611000110360133901257160 分化培养基:MS +AgNO 33mg L -1+110%琼脂+不同的激素浓度配比BA 浓度在2～1mg L-1,NAA 在1～015mg L -1之间,芽分化频率都在90%以上.在这个浓度范围内,随着外源激素浓度的降低,平均每个外植体产生的芽数减少,但玻璃化程度减轻,从67154%降至43136%.当外源激素进一步降低时,虽然玻璃化程度进一步降低,但是同时芽分化率也明显降低,因此外源激素不能降得太低.以上数据表明,在结球白菜再生中,BA 、NAA 浓度高时更容易刺激芽的发生,但浓度过高会影起分化芽内内源激素水平失调而使芽玻璃化.212 琼脂浓度对成苗的影响表2 琼脂浓度对成苗的影响琼脂浓度Π%外植体芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%018440186137311193137110720197201217943137114410190751183111311639012815013826147 分化培养基:MS +BA 1mg L -1+NAA 015mg L -1+AgNO 33mg L -1+不同浓度琼脂培养基中的琼脂浓度,影响培养基中可利用水分及容器内的相对湿度.从表2可知,在一定范围内提高琼脂浓度,可减少结球白菜再生过程中玻璃苗的形成.当琼脂浓度为018%时,在几乎无正常苗的形成.当琼脂浓度提高到114%时,外植体芽发生率在90%以上,芽玻璃化程度却明显减轻.但当琼脂浓度进一步提高到116%时,不利于芽的分化,且玻璃化程度比琼55第3期成细华等:结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究65首都师范大学学报(自然科学版)2001年脂浓度为114%高,可能是因为琼脂浓度太高,培养基变得很硬,营养物质和激素很难被培养的组织吸收,因而影响了芽的分化和发育.213 容器对成苗的影响表3 容器对成苗的影响容器外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π%平皿a720197201217943137三角瓶a30019685218344109平皿b470198193411167154三角瓶b300197131413568190 a—分化培养基为MS+BA1mg L-1+NAA015mg L-1+AgNO33mg L-1+110%琼脂b—分化培养基为MS+BA2mg L-1+NAA1mg L-1+AgNO33mg L-1+110%琼脂由表3知,培养容器不同不是影响结球白菜玻璃化的主要原因.用两种分化培养基,同时将子叶2子叶柄均匀接种于平皿和三角瓶中,在2000lx,16hΠ8h培养两星期,相对于同一种培养基,培养皿和三角瓶中外植体形成愈伤时间、大小及产生芽的时间基本一致,芽的玻璃化程度相差不大.将带丛生芽的外植体转于MS基本培养基上生长两周,统计发现,出芽总数和芽的玻璃化率只跟激素组成有关,而与培养容器无关.214 AgN O3对成苗的影响表4 AgN O3对成苗的影响AgNO3浓度Πmg L-1外植体数芽分化率出芽总数芽数Π外植体玻璃化率Π% 1100340176581171371632100420180801190401153100720197201218343137 分化培养基:MS+BA1mg L-1+NAA015mg L-1+110%琼脂+不同浓度的AgNO3在芸薹属作物的再生过程中,常添加AgNO3来抑制乙烯的作用,促进芽的发生.由表4可浓度为1～3mg L-1时,芽分化率上升,每个外植体产生的芽数也增多,但对芽以看出,当AgNO3的玻璃化程度影响很小.3 讨 论本实验发现,激素浓度和琼脂浓度对结球白菜玻璃苗发生均有一定的影响,而降低AgNO3浓度或改用通气性好的三角瓶,对结球白菜玻璃苗形成影响不显著.朱青松在烟草髓的再生研究中发现,培养基中的BA和NAA高皆引起分化芽的玻璃化,他认为,外源激素水平影响着内源I AA的含量,从而影响分化芽的状态[8].本实验通过降低BA 和NAA两者的浓度,降低了结球白菜组织培养中玻璃苗的形成.植物细胞在体外培养过程中会产生乙烯,尤其在密闭的容器中,乙烯通过累积会达到一个过高的浓度,影响植物的生长发育.Chi认为,在B.campestris的再生中,高水平的乙烯易引起的有无,琼脂浓度的高低,影响着容器芽分化率降低,导致再生芽生长发育的玻璃化[8].AgNO3中乙烯的含量[9,10].张凤兰在对结球白菜的研究中发现,琼脂浓度越高,乙烯产生量越少,当培养基的琼脂浓度达到116%时,得到的芽发生率高,且平均每个外植体得到的芽也多.本研究所得结果与此不太一致.当琼脂浓度在018%～114%范围内,随着琼脂浓度的提高,芽分化率变化很小,芽的玻璃化率却显著降低.但当琼脂浓度升至116%时,芽分化率迅速降低.分析其原因,可能是因为琼脂浓度太高,培养基变得很硬,营养物质和激素很难扩散到培养的组织中去[11].AgNO 3同时增加了芽分化能力和乙烯产量[9],因此推测AgNO 3是通过Ag +竞争性地与乙烯在膜上的受体相结合而抑制乙烯的作用[9～11].张松认为,当AgNO 3含量高于12mg ΠL 时,对结球白菜芽分化产生抑制作用,出芽率下降,且易产生畸形苗[12].本实验在AgNO 3浓度不超过3mg ΠL 的情况下,没有观察到AgNO 3浓度的变化对结球白菜玻璃芽产生的影响.在外植体再生建立过程中,往往由于外植体产生的致死性褐化物而使实验失败.为了防止褐变和有害物质的积累,常在培养基中加入活性炭(AC )以吸收有害物,降低其不利影响[13].王家旺在培养基中加入013%的AC 降低了油菜茎尖培养过程玻璃芽的产生[13].本实验中,在分化培养基中加入110%的AC ,只有子叶的膨大,没有芽的分化,可能是AC 在吸收有害物的同时,也吸附了生长调节物质和其它培养基成分[13].在培养基中添加不同浓度的蔗糖(3%、6%、9%),观察其对玻璃芽形成的影响.实验发现,随着蔗糖浓度的增高,不但不能抑制玻璃芽的发生,反而明显抑制不定芽的分化.这与胡开林在青花菜组培再生上的研究结果一致[14].这说明提高培养基的渗透压不能有效地抑制玻璃芽的发生.参考文献1 卜学贤,陈维伦.试管植物的玻璃化现象.植物生理学通讯,1987,23(5):13～192 程振东,卫志明,许智宏.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生.植物学报,1994,36(9):657～6633 刘非燕,郭达初.重瓣丝石竹试管苗玻璃化发生原因初探.杭州大学学报,1996,23(4):282～2874 张洪胜,牟云官,辛培刚.苹果离体培养中试管苗玻璃化现象发生机理探讨.林业科学,1992,17(3):10～125 Bottcher C H ,V ogelmann T C.E ffect of righdity of gel medium on benzyladenine 2induced adventitious bud forma 2tion and vitrification in Picea abies .Physiology Plant ,1984,61:505～5126 Z im M ,Meir G,Harlevy A.Factors in fluencing the production of harded glaucous Carnation plantlets in vitro.PlantCell ,T issue and Organ culture ,1982,2(1):55～657 Leshem B ,Shaley D P ,I zhar S.The effect of cytokinins on vitrification in melon and carnation.Annals of Botany ,1988,62(2):272～2768 朱青松,梅康凤,王沙生.外源生长素对烟草髓愈伤组织分化和内源I AA 含量的影响.北京林业大学学报,1999,21(1):22～259 Chi GL ,Pua E C ,G oh C J ,et al .R ole of ethylene on de novo shoot regeneration from cotyledon explants of Bassi 2Bca campestris ssp.pekinensis (Lour )Olss on in vitro .Plant Physiol ,1991,96:17010 F L Zhang ,Y T akahata ,J B Xu.Medium and genotype factors in fluencing shoot regeneration from cotyledonaryexplants of Chinese cabbage (Brassica campesstris L.ssp.pekinensis ).Plant Cell Reports ,1998,17:780～78611 张鹏.硝酸银和脱落酸相配合影响菜心离体培养之植株再生方式的组织学研究.热带亚热带植物学报,1996,4(1):7112 张松,魏毓棠,等.利用乙烯抑制剂AgNO 3建立结球白菜高频植株再生体系.园艺学报,1997,24(1):94～96(下转第64页)75第3期成细华等:结球白菜组培再生苗玻璃化问题初步研究46首都师范大学学报(自然科学版)2001年Alien G enes T ransferred to Wheat ThroughI nduced T ranslocationHu Y ingkao(Department of Biology,Capital N ormal University)AbstractThe acheivement of alien genes trans ferred to wheat through induced translocation was reviewed. Alien gene res ources used to trans fer and methods of producing translocation were introduced.Transloca2 tion line induced methods and gene res ources were analysed.The perspective was als o given in the paper.K ey w ords:wheat,alien gene,translocation line(上接第57页)13 刘用生,李友勇.植物组织培养中活性炭的使用.植物生理学通讯,1994,30(3):214～2114 胡开林,杨瑞还.青菜花试管苗玻璃化发生及克服途径的初步研究.华南农业大学学报,1998,19(4):63～66Vitrification of R egeneration Shoots of Chinese C abbageCheng X ihua(Department of Biology,Capital N ormal University)Liu Fan Cao Mingqing(Beijing Vegetable Reseach Center)AbstractMedium gradient and culture conditions in plant tissue culture of Chinese cabbage were studied.The vitrification of regeneration shoots of Chinese cabbage in vitro was m ostly affected by horm ones concentra2 tion and agar concent.T o s ome certain,the normal shoot regeneration was facilitated by decreasing hor2 m one concentration of increasing agar concentration.But there is no evident effect for inhibiting the occur2 rence of vitreous shoot by decreasing AgNO3concentration or changing culture dishes into culture flasks.K ey w ords:Chinese cabbage,vitrification,thssue culture。