大孔吸附树脂对杜仲叶黄酮的富集纯化

大孔吸附树脂对杜仲叶黄酮的富集纯化付桂明1，罗阳帆2，张娅楠2，万 茵2，柴建新2，陈勇辉1，吴晓芳1，陈建芳1(1.南昌大学中德食品工程中心，江西 南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330047)摘 要：应用大孔吸附树脂对杜仲叶超临界法提取液中的黄酮类物质进行富集和纯化，得到树脂富集杜仲叶黄酮的最优工艺条件。

对4种大孔吸附树脂NKA-2、X-5、D101、AB-8的吸附和解吸能力进行比较的结果表明：AB-8树脂的吸附率和解吸率都最高，最佳吸附洗脱工艺为上样液黄酮质量浓度193.92mg/mL 、pH2、吸附流速2.6mL/min 、洗脱流速1.6mL/min 、解吸剂80%乙醇用量30mL 。

所得洗脱液中黄酮质量分数从纯化前的10.2%可增加到纯化后的42.6%以上。

关键词：杜仲叶黄酮；富集纯化；大孔吸附树脂Using Macroporous Resin for Enriching and Purifying Total Flavonoids from the Crude Extract ofEucommia ulmoides Oliv. LeavesFU Gui-ming 1，LUO Yang-fan 2，ZHANG Ya-nan 2，WAN Yin 2，CHAI Jian-xin 2，CHEN Yong-hui 1，WU Xiao-fang 1，CHEN Jian-fang 1(1. Sino-German Food Engineering Centre, Nanchang University, Nanchang 330047, China ；2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)Abstract ：In this study, the leaves of Eucommia ulmoides Oliv. were extracted with absolute ethanol to obtain flavonoid compounds. The crude extract was purified using 4 macroporous adsorption resins, and AB-8 was found to be the best choice due to both the highest adsorption and desorption capacity. The optimum conditions for adorption/desorption of the crude extract of the leaves of Eucommia ulmoides Oliv. were as follows: sample concentration 193.92 mg/mL at pH 2, sample flow rate 2.6 mL/min, desorption flow rate 1.6 mL/min and amount of 80% ethanol required for desorption 30 mL. After the optimized purification, the concentration of flavonoids was improved from 10.2% to 42.6%.Key words ：Eucommia ulmoides leaf flavonoids ；enrichment and purification ；macroporous resin中图分类号：TS201.2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)14-0067-04收稿日期：2009-11-09基金项目：江西省自然科学基金项目(2008GQN0042)作者简介：付桂明(1972—)，男，副教授，博士，主要从事天然产物及其应用研究。

E-mail ：wanyin_0@杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科杜仲属植物，为我国第三季残留古生物的特有树种。

我国对杜仲的传统利用仅限于杜仲皮，但越来越多的研究已经表明，杜仲叶与杜仲皮的有效成分基本相同，而且某些成分的含量还超过杜仲皮，杜仲叶作为功能性食品的基料，其药理及保健作用正在越来越多地为人所认识。

生物类黄酮是自然界中存在的酚类物质，亦称V P ，常与V C 伴存，属植物次级代谢产物。

它具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生理活性，因此受到国内外学者的广泛关注，成为研究开发的热点课题[1]。

成军等[2]从杜仲叶中分离得到7个化合物，用波谱方法鉴定其为：5个黄酮类化合物：山奈酚(kaempf erol)、槲皮素(quercetin)、紫云英甙(astragalin)、陆地锦甙(hirsutin)、芦丁(rutin)；1个简单的酚类化合物：3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydrobenzoic acid)；1个葡萄糖乙甙(ethyl glucopyranoside)。

大孔吸附树脂是20世纪60年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有多孔网状结构和较好的吸附性能[3]。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附剂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。

近年来，大孔吸附树脂已广泛用于制剂和天然植物中活性成分(如皂苷、总黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物)的提取分离与纯化，并取得了一些满意的效果[4]，参考文献资料，大部分运用大孔树脂NKA-2、X-5、NKA-9、D101、AB-8、S-8纯化总黄酮，并得到较高得率和纯度，为节约资源，本实验采用NKA-2、X-5、D101、AB-8 4种树脂，筛选最优吸附剂。

1材料与方法1.1材料、试剂与仪器杜仲叶，购自江西省萍乡市。

乙醇(分析纯)、NaNO2(分析纯)、Al(NO3)3·9H2O (分析纯)、NaOH(分析纯)、槲皮素(C15H10O7·2H2O)标准品上海化学试剂公司。

大孔吸附树脂NKA-2、X-5、D101、AB-8 南开大学树脂厂。

722S分光光度计上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；Speed SFE-2型超临界流体提取仪Applied Separations公司；DFY-500摇摆式高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂；PY-150S-11数控摇床汇城科技生物公司。

1.2超临界技术提取杜仲叶总黄酮1.2.1杜仲叶粉末制备将杜仲叶干燥、粉碎、过40目筛、称量、塑料袋密封保存。

1.2.2超临界法提取总黄酮取100g杜仲叶粉末装入萃取缸中，加450mL无水乙醇，提取压力28M P a、温度35℃、提取2.5h。

重复操作1次。

将两次提取液合并、浓缩，得膏状物，并置于冰箱4℃保存[5]。

1.2.3提取液中总黄酮含量的测定将超临界提取的膏状物加水定容至250mL，混匀。

取其中1mL稀释10倍，为待测液。

吸取待测液1mL各3份，分别向待测液中加入质量分数5%NaNO2溶液0.1mL，摇匀、放置6min，加入质量分数10% Al(NO3)3溶液0.1mL，摇匀、放置6min，再分别加入1mol/L NaOH 溶液4mL，摇匀、放置15min，于510nm波长处测吸光度，以槲皮素为标准品绘制标准曲线[6]，得标准曲线方程为y=0.6951x－0.0006，R2=0.9988。

根据标准曲线算出提取液中总黄酮质量浓度15.64mg/mL，杜仲叶粉末提取出的总黄酮得率为12.12mg/g。

1.3树脂的选择[7]1.3.1树脂预处理无水乙醇浸泡树脂24h，抽滤、醇洗，至洗出液加水不混浊(取1mL乙醇洗出液加5mL水不混浊)为止，然后水洗至无醇。

用2BV质量分数5%盐酸浸泡2h，水洗至近中性，再用2BV质量分数2%氢氧化钠溶液浸泡2h，水洗至近中性，过滤，备用。

1.3.2树脂吸附量的测定[8]将4种树脂各称取3份，每份500mg，置于具塞三角瓶中，再分别加入提取液20mL，于电动振荡机上振荡20h，频率120r/min，温度20℃。

过滤，准确移取滤液1mL，测定总黄酮质量浓度。

按式(1)计算各树脂在室温下的吸附量：Q=(C1－C2)×V/m (1)式中：Q为吸附量/(mg/g)；C1为提取液的总黄酮质量浓度/(mg/mL)；C2为剩余总黄酮质量浓度/(mg/ mL)；V为溶液体积/m L；m为树脂质量/g。

1.3.3树脂解吸量的测定[8]将上述4种已吸附黄酮至饱和的树脂，分别投入体积分数为70%、80%、90%的乙醇溶液20mL中，按上述方法浸泡振摇20h。

过滤测定滤液中总黄酮质量浓度，按式(2)计算总黄酮解吸量：Q=C×V/m (2)式中：Q为解吸量/(mg/g)；C为提取液的总黄酮质量浓度/(mg/mL)；V为溶液体积/mL；m为树脂质量/g。

1.4树脂富集纯化黄酮的条件优化1.4.1上样液pH值对纯化效果的影响　大孔吸附树脂AB-8湿法装柱后以pH值分别为1.0、2.0、3.0、5.0、6.0的超临界提取液上样使其充分吸附，蒸馏水洗至无色，以80%乙醇溶液40mL进行洗脱，测定洗脱液总黄酮含量，考察p H值对纯化效果的影响。

1.4.2吸附流速对纯化效果的影响大孔吸附树脂AB-8湿法装柱后超临界提取液上样，控制流出口流速，测定流出液中剩余黄酮含量，考察不同流速对纯化效果的影响。

1.4.3解吸流速对纯化效果的影响大孔吸附树脂AB-8湿法装柱后将超临界提取液上样，让树脂对其充分吸附后，水洗至流出液为无色，在用80%乙醇溶液40mL进行洗脱时，对洗脱液流出速度进行控制，收集流出液，测定其中黄酮含量，考察解吸流速对纯化效果的影响。

1.4.4解吸剂用量对解吸效果的影响大孔吸附树脂AB-8湿法装柱后将超临界提取液上样，让树脂对其充分吸附，水洗至流出液无色后，加入80%乙醇溶液洗脱，按5mL/管收集流出液，测定各管流出液中黄酮含量。

1.4.5上样液总黄酮质量浓度对吸附及洗脱效果的影响大孔吸附树脂AB-8湿法装柱后以梯度浓度的杜仲叶提取液上样使其充分吸附，先用蒸馏水洗至无色，再用80%乙醇溶液40mL进行洗脱，测定不同质量浓度的杜仲叶提取液在大孔树脂上的吸附量和解吸量，计算吸附率和解吸率。

1.5吸附动力学曲线准确称取AB-8树脂0.5g ，加入样液20mL ，于具塞三角瓶中，放置于摇床上，按照上述最优条件振摇吸附，每隔一定时间取溶液1mL 测定吸光度，以时间为横坐标、510nm 波长处吸光度为纵坐标，绘制AB-8树脂对杜仲叶黄酮的吸附曲线。