酶工程复习L

第一章酶学与酶工程

1、化学酶工程指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用

2、生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括3个方面：用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)；修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)；设计新的酶基因合成自然界 不曾有的新酶

3、何为酶工程？由哪几个部分组成？

酶工程(enzymeengineering)是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将 相应原料转化成有用物质的技术，是生物工程的重要组成部分。

由4个部分组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器

4、酶的结构有何特点？（P5)

(1) 一级结构：蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸排列顺序和连接方式。

(2) 二级结构：由多肽链主链骨架盘绕折叠，依靠氢键维持固定所形成的有规律性的结构称为蛋白质的二 级结构。二级结构与侧链R的构象无关。维持二级结构稳定的化学键主要是氢键。

(3)超二级结构和结构域：由二级结构间组合的结构层次称为超二级结构。超二级结构一般以一个整体参 与三维折叠，充作三级结构的构件。结构域为蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖 区

(4)三级结构：是建立在二级结构、超二级结构，乃至结构域的基础上的。包括多肽链中一切原子的空间 排列方式。维持蛋白质三级结构稳定的力主要是非共价键

(5)四级结构:由数条具独立的三级结构的多肽链彼此通过非共价键相互连接而成的聚合体结构就是蛋白 质的四级结构。

一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）

二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）

超二级结构（相邻二级结构的聚集体）

I

结构域（在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构）

I

三级结构（球状蛋白质中所右原子在空间中的相对位置）

I

四级结构（亚基聚合体）

5、何为酶活性中心？酶的作用机制有哪几种学说？

酶的活性部位(a c tiv e s ite)是酶分子中直接参与和底物结合，并与酶的催化作用直接有关的部位，它是酶行使 催化功能的结构基础。

锁和钥匙模型：

底物的形状和酶的活性部位被认为彼此相适合，像钥匙插入它的锁中，两种形状被认为是刚性的(r ig id)和固 定的(fixed)，当正确组合在一起时，正好互相补充。

诱导契合模型：

是1958年由D an iel E. Koshland J r.提出的，底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化。

6、影响酶活力的因素有哪些？

底物浓度、酶浓度、产物浓度、PH、温度、抑制剂、激活剂

7、蛋白质的粗分离过程包括哪些步骤？如何进行？（P20)

(一)材料的选择和细胞抽提液的制备

1.材料的选择

目的蛋白质含量要高，而且容易获得

2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备

为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，

(1)应当使用类似于生理条件下的缓冲液。

(2)动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪，切碎后放人捣碎机中。

(3)完全破碎酵母和细菌细胞

3.膜蛋白的释放

膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周蛋白质和固有蛋白质两种类型4.胞外酶的分离

胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得 发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。

(二)蛋白质的浓缩和脱盐

经硫酸铵沉淀的蛋白质在作进一步提纯以前，常要除盐(即降低离子强度)。常用的除盐方法有透析法、纤 维过滤透析法和分子筛层析法

浓缩蛋白质溶液的方法

1沉淀法：用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积溶液中。

2吸附法：将蛋白质吸附到离子交换剂上，然后用少量盐溶液洗脱下来。

3干胶吸附法：向蛋白质溶液中加入固体SephadexG-25等吸水剂，吸去水及一些小分子物质，但蛋白质收得率较低

4渗透浓缩法：将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在密闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外，蛋白质即被浓缩；也可将聚乙二醇(PEG)涂于装有蛋白质溶液的透析袋上，置于4°C下，干PEG粉末吸收水和盐类，大分子溶液即被浓缩，PEG吸水很快，100ml蛋白液在较短时间内就能浓缩到几毫升。

5超滤浓缩法：这是浓缩蛋白质的重要方法。近年国外已生产各种不同型号的超滤膜，可以用来浓缩分子质量不同(350—300 000 u)的物质，现将其部分列于表1 一10中。

(三)沉淀法分级蛋白质

凡能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素，都可能降低蛋白质在水中的溶解度，使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。

8、怎样进行蛋白质的大规模分离纯化？可采取哪些方法？（P25)

(一)蛋白质的来源及释放

对于大规模纯化来说，还是以微生物作为来源为好，这是因为微生物含有很多哺乳动物中没有的有用蛋白质和酶制品，而且可以采用微生物遗传较容易地筛选出新的高活力蛋白质和酶制品；细菌可以任何规模生产，这就保证了供应的连续性；

利用遗传工程方法足可在细菌中高水平表达所需要的蛋白质和酶。

(二)分离和浓缩

⑴离心

大规模纯化需要工业用连续流动离心机。

(2)过滤

过滤是从细胞抽提物中除掉固体的另一种方式。然而，微生物抽提液常有凝胶化的趋向，难于用传统方法有效过滤，常发生严重堵塞，除非加大过滤面积，但这是一个花钱多的解决办法。最近一个技术上的进步是研制了涡流膜过滤法它可以代替离心法。

(3)双水相体系萃取法

(4)浓缩技术常用的适于大规模操作的浓缩技术有两种：沉淀法和超滤法

(三)大规模层析技术

1.离子交换层析

2.凝胶过滤层析

3.疏水层析