4种子扩大

3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代 替， 浓度为2.5% 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时 培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求： 108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东， 发酵科技通讯，2003,7
背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%左右） 二级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%以上） 文章：三级种子工艺 斜面→一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）→二级种子（2m3） →三级种子（20m3)→发酵（240m3)
培养基成分表
2、接种龄与接种量
• 种龄：是指种子罐中培养的 菌丝体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。 • 通常种龄是以处于生命力极 旺盛的对数生长期，菌体量 还未达到最大值时的培养时 间较为合适。时间太长，菌 种趋于老化，生产能力下 降，菌体自溶；种龄太短， 造成发酵前期生长缓慢。 • 不同菌种或同一菌种工艺条 件不同，种龄是不一样的， 一般需经过多种实验来确定。 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋 白酶，12小时最好。
种龄：最佳种龄应选择在对数生长期。
黑曲霉在蔗糖合成培养基上培养不同时间与产柠檬酸的关系
培养时间（d） 产酸率（%）培养时间（d）产酸率（%） 3 47.1 10 69.3 6 71.1 15 49.1
3、接种量
• 接种量：是指移入的种子液 体积和接种后培养液体积的 比例。 • 接种量的大小决定于生产菌 种在发酵罐中生长繁殖的速 度，采用较大的接种量可以 缩短发酵罐中菌体繁殖达到 高峰的时间，使产物的形成 提前到来，节约发酵培养的 动力消耗，提高设备利用 率，并可减少杂菌的生长机 会。 • 但接种量过大或者过小，均 会影响发酵。过大会引起溶 氧不足，影响产物合成；而 且会过多移入代谢废物，也 不经济；过小会延长培养时 间，降低发酵罐的生产率。
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体 前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病 治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理 功能。因发酵法生产Υ亚麻酸与从天然植物提取相比具有一 系列优点，发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。 Υ亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的 形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵Υ亚麻酸 时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
第四章
种子的扩大培养
种子扩大培养定义 • 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在 经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获 得一定数量和质量的纯种培养物的过程。
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
三、 生产发酵罐的无菌接种
• 生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：
– 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一 个种子罐， – 从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
从种子罐接种
种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种 →摇瓶种子培养 →一级种子罐培养
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当，有利于孢 子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
用途 保藏 斜面 一级 二级 三级 成分（%） 牛肉膏 （英国） 1，蛋白胨（日本）1，琼脂粉 （日本）1.8， 无机盐 添加 0.1的口服葡萄糖，其余同上 口服葡萄糖 盐等 3， 玉米浆 2.4，尿素 0.65，无机 ，甘蔗糖 1200 ml /5000 ml 1.2 / 2 m3 12 / 20 m3 规模
• 确定种子罐级数需注意的问题 扩大培养级数应以保证发酵所需接种量 和尽量减少移种次数为前提。
– 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会 – 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 – 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
玉米淀粉双酶糖 2.0， 玉米浆 2.0 蜜 1.0, 尿素 0.35， 无机盐等
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机盐 等 玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.060.08 ，甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐等
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。 在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
1、种子罐级数的确定
• 种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长 繁殖成菌丝，接入发酵罐能迅速生长，达 到一定的菌体量，以利于产物的合成。 • 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培 养的次数，取决于：
→发酵
1、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超 过3次
2. 一级种子（摇瓶） 培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1% 培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青 期，4-6期合成青霉素的能力最强
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
本研究发现，采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明 显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌 7~15%，有时20~25% 为加大接种量，还采用双种法（2个种子罐对1个 发酵罐）或倒种法（倒出部分发酵液作为种子给 另一发酵罐），还有添加法等其他一些方法。
二、生产车间种子制备
• 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子 罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌 种而异，但其原则为采用易被菌利用的成 分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是 需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气， 并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均 匀分布，获得相同的培养条件。
车间种子制备培养基选择的原则
3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培 养基，培养基中含有一些适合产孢子的 营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨 和一些无机盐等。 培养温度一般为28˚C。 培养时间为5~14天。
（二）扩大种子的制备
1 液体培养法 A 好氧培养：
• 用三角瓶培养微生物，如 何实现溶氧的控制？
B 厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒 等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
二、青霉素生产的种子制备 制备过程 安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 二级种子 → 发酵

→ 一级种子
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意控制湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
种子的制备过程
• 种子制备的过程大致可分为
一、实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床 等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子 培养。 二、生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工 程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生 产车间阶段。
２ 固态培养法： 对于一些产孢子能力强，以及孢子发芽， 生长繁殖快的菌种。采用固体培养基大量产生 孢子，用孢子直接接种，简便，不易污染。 利用三角瓶，克氏瓶等。
实验室种子制备培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
发酵
154 / 240 m3
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
工艺 三级种子 二级种子 ② 糖酸转化率高且稳定 工艺 三级种子 二级种子 产酸（%） 10.93 9.8 糖酸转化率 （%） 59.8 58 单罐产量 (吨） 21 18 8小时产酸 （%） 2.2～2.7 1.0～1.5 12小时产酸 （%） 4.6～5.2 2.6～3.4 发酵周期 （h) 32 35
– 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； – 所采用发酵罐的容积
细菌： 生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 斜面菌种→―级种子摇床培养 →种子罐→发酵罐 霉菌： 生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产 生菌丝 ）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时，菌体迅 速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌： 生长更慢，采用四级发酵 酵母： 比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子