柑橘青_绿霉病高效拮抗菌34_9的筛选及其特性研究

用平板打孔培养法，先在混有柑橘青、绿霉病的
平板上打 2 孔：其中 1 孔内注入上清液或热处理液 0.5 ml，另 1 孔注入对照 0.5 ml，置于 25～28℃恒温培养 箱中培养 1 周观察抑菌情况。 1.2.4 酵母菌株（34-9）鉴定 （1）形态特征：在 麦芽汁琼脂培养基上 25℃培养 2～4 d 后用电子显微 镜及光学显微镜进行常规菌体形态观察。（2）培养特 征：在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上 25℃培养 2～4 d 后观察其菌落形态及菌体颜色。（3）生理生化试验： 参照文献[12, 13]的具体方法对菌株进行生理生化鉴 定。 1.2.5 扫描电镜观察[14] 采用改进的培养皿培养法： 在培养皿内倒入 15 ml 左右的豆芽汁琼脂培养基，冷 却后，先在培养基表面铺上微孔滤膜（0.22 µm），然 后在微孔滤膜表面滴上 30 µl 的柑橘青、绿霉病病菌 （103spores/L），再滴上酵母菌株（34-9）的悬浮液 （102cells/L），然后放置于 25°C 培养。分别在培养 12、 24、36 和 48 h 后，取出微孔滤膜，在光学显微镜下观 察到有重寄生现象发生时，用玻璃刀切取分子筛膜边 缘长有菌丝的小块分子筛膜，在室温下用 3%戊二醛 （0.1mol·L-1 磷酸缓冲液 pH 7.0）固定 2 h 后用 Edwards S 159A 离子溅射机镀金 15 min，样品真空干 燥。用日本产的 Hitachi S-450 扫描电镜，于 20 kV 电 压下观察拍照。 1.2.6 统计分析 所有试验数据采用 ANOVA 进行 邓肯氏多重差异分析。
关键词：柑橘青霉病；柑橘绿霉病；拮抗菌；柠檬形可勒可酵母
Characteristics and Identification of an Antagonistic Yeast 34-9 Against Blue and Green Mold of Citrus
LONG Chao-an, DENG Bo-xun, HE Xiu-juan
先用琼脂移块法初选，再对有抑制圈的菌株采用 平板对峙培养法复筛[11]。然后选取外观整齐、大小和 成熟度一致、无病虫为害的果实，用接种针在每个果 实的腰部刺 4 mm2 伤口，同时接种 0.02 ml 的 106cfu/ml 酵母菌悬浮液和 0.02 ml 的 105 个/ml 青、绿霉病菌的 孢子悬浮液，接种果实置于套薄膜袋的塑料盒中，保 持相对湿度在 95%左右，2 h 后置于 28℃的培养箱中。 第 2 天开始观察，每天观察 1 次，6 d 后统计柑橘青、 绿霉病的发病率。各处理为 10 个果实，重复 3 次。 1.2.2 酵母菌株（34-9）对柑橘青、绿霉病菌离体防 效试验 先分别接种 0.02 ml 的 106cfu/ml 酵母菌悬浮 液，将果实放在塑料盒内，贮于 25℃，分别于 24 h 和 48 h 后再分别接种 0.02 ml 的 105 个/ml 青、绿霉病 菌的孢子悬浮液，塑料盒于塑料袋内，以保持 95%左 右的相对湿度，2 h 后贮藏于 28℃。第 2 天开始观察， 每天观察 1 次，统计柑橘青、绿霉病的感病情况。 1.2.3 酵母菌株（34-9）产生抗生素研究 从琼脂斜 面上取一环拮抗菌于豆芽汁琼脂培养基平板上划线后 在 25℃培养 48 h，再用接种环取一环于盛有 100 ml 豆芽汁液体培养基的 250 ml 三角瓶中，于 25℃下振 荡培养 48 h 后，制备 3 种处理液：（1）培养的活菌液 （浓度为 108cfu/ml）；（2）热处理液（培养基在 100℃ 水浴中处理 5 min）；（3）上清液（培养液在 6 000 r/min 下离心 10 min）。对照为 30 mg·L-1 制霉菌素。
Key words: Penicillium italicum; Penicillium digitatum; Antagonistic microorganism; Kloechera apiculata
采后病害是果蔬损失的主要原因之一[1, 2]，目前有 效的防治技术是使用大量的化学杀菌剂[3]。长期使用 杀菌剂，易导致病菌产生抗药性，只有加大用药剂量 以控制病害，从而增加了生产成本和农药残留量。实 际上人们越来越担心食物链中化学残留物对人类健康 的影响，要求降低果蔬产品用药量，许多生产上常用 的杀菌剂已被明令禁止使用。于是，寻求安全、无毒、 有效的控制采后果蔬腐烂的方法成为当务之急。其中 利用拮抗微生物防治采后病害有望成为代替化学药剂
Abstract: A yeast strain was tested for its antagonistic activity against blue mold (Penicillium italicum) and green mold (Penicillium digitatum) of citrus fruit in bean sprout juice agar (BSJDA) medium. The strain (34-9) was identified as Kloeckera apiculata and showed the highest antagonistic activity against citrus blue mold and green mold on pair-culture against P. italicum and P. digitatum of citrus and on wounded citrus fruit. There was no antagonistic activity of fermentated filtrate and after sterilization. Observation by scanning electron microscopy revealed attachment of the yeast cells to the pathogen hyphae, indicating that the high antagonistic activity of the yeast may be contributed by the competition for space and nutrients and /or involvement of direct antagonist of the yeast on the fungus.
酵母菌株（34-9）在柑橘果实表面能够显著抑制 柑橘青、绿霉病菌对果实的侵染（图 1），酵母活菌液 处理后 24 h 和 48 h 分别接种柑橘青、绿霉病菌的果实， 25℃贮至 6 d 没有病斑出现，而对照的果实发病率分 别为 23.3%和 27.8%，其防治效果明显好于对照果实。 2.3 抗生素测定
收稿日期：2005-01-31 基金项目：国家自然科学基金项目（NNSFC-30371018）和湖北省科技计划项目（4006-036030）资助 作者简介：龙超安（1976-），男，江西吉安人，博士，主要从事果品保鲜生物技术研究。邓伯勋为通讯作者，Tel: 027-87282010; Fax: 027-87282095;
的一种安全、无毒及有效的新方法[4~8]。 柑橘青霉病和绿霉病是柑橘采后主要的两大贮藏
病害。据统计，由于青霉病和绿霉病的感染柑橘采后 损失为 30%～50%[9]。为了寻求安全、有效和无污染 的方法，人们把目光转向了生物防治。
本研究大量筛选能够控制柑橘青霉病和绿霉病的 酵母拮抗菌，从中挑选 10 个效果较好的酵母拮抗菌用 于果实表面接种试验。确定效果最佳的菌株 34-9，并 探讨可能的抗病机理。
E-mail: bxdeng@
12 期
龙超安等：柑橘青、绿霉病高效拮抗菌 34-9 的筛选及其特性研究
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1 材料与方法
1.1 材料 供试柑橘品种为国庆 1 号（Citrus. unshiu Tanaka cv.
Guoqin 1），2002 年 10 月 16 日采于华中农业大学柑橘 园，用于拮抗和贮藏试验。柑橘青、绿霉病病菌分离 于自然发病的柑橘果实表面；制霉菌素购于武汉天源 生物技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1 酵母菌株（34-9）的分离与筛选 在湖北、江 西和湖南等柑橘产区采集柑橘果实（尾张、国庆 1 号、 椪柑和纽荷尔脐橙等）和柑橘园根际土壤，每份各称 取 10 g（果实取果皮，土壤过滤筛后取细土），置于 90 ml 豆芽汁液体培养基中，25℃下以 200 r/min 振荡 培养 48 h，然后分别吸取 1 ml 菌液用浓度梯度法涂布 于豆芽汁琼脂（BSJDA）平板上[10]，置于 25～28℃恒 温培养箱中培养 48 h 后挑取培养特征相异的单个菌 落，经反复纯化后待测。
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education/National Center of Citrus Breeding/ College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070 )
表 1 酵母菌株（34-9）对柑橘青、绿霉病的抑制效果
Table 1 Inhibitory effects of 34-9 yeast strain on blue mold and green mold in citrus fruits
菌株 Strain
发病率 Infection rate (%)
P27-12
30e
33.3e
CK
100a
100a
同列相同字母表示邓肯多重检验差异不显著（P＜0.05)
The same letter in a column means no significant difference at P＜0.05 by Duncan’s multiple range test
2 结果与分析
2.1 分离与筛选结果 用琼脂移块法和平板对峙培养法检测分离对柑橘
青、绿霉病菌有抑制作用的酵母菌 10 株。再通过果实 表面接种培养法测定筛选到 34-9 菌株，其拮抗能力最 强，经过 3 次重复测定其发病率均较低，存放 6 d 不 发生青霉病，绿霉病发病率只有 10%，显著低于对照 和其它菌株（表 1）。 2.2 离体防效试验