高致病性禽流感血凝HAppt课件
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加蒸馏水至100毫升，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69千帕， 15分钟的高压灭菌，放置在4℃的环境内，保存备用。
阿氏液主要用于保存红细胞，在4℃的环境下，红细胞可以保存2 周而不改变活性和特性。因此阿氏液用于采血、保存和运送红细胞进 行化验。
2、1%鸡红细胞悬液制备
采血 用注射器吸取阿氏液1ml，取至少3只SPF公鸡或无禽流感和 新城疫等抗体的健康公鸡的血液3-4ml，与等量的阿氏液混匀，装入离 心管中备用。
第2孔用同样次数吹吸混匀吸取25ul加入到第3孔，如 此进行到第5孔弃去25ul，换滴头。 5、每孔再加入25ulPBS。 6、每孔均加入25ul1%RBC液。 7、振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察 结果。
血凝试验（抗原效价的测定）操作表
孔号
12
3
4
5
6
病毒稀释 度
2*
1*
0.5
• 用来检测禽流感疫苗免疫水平
实验准备工作
试验用溶液的配制
1、鸡红细胞保存液（阿氏Alsevers液)配制 阿氏液（Alsever's Solution）是一种红细胞保存液，含有抗凝剂
柠檬酸钠和细胞需要的养分葡萄糖。 葡萄糖--- 2.05克 柠檬酸钠-- 0.8克 柠檬酸-- 0.055克 氯化钠 ---0.42克
25 25
25
25 25 25 25
25 25 25
25
25 25
25
25
1%红细胞
微型振荡器1min，静置30min
结果观察
++++
++ ++
++++
++++
++++ ++++
++++
++++
+
弃50
+
-
-
抗原效价的测定结果判定
1、红细胞100%凝集的抗原最高稀释度为血 凝价。 2、“++++”为100%凝集，“++”为不完全 凝集，“—”为不凝集 3、上表例抗原血凝为256 4、对照孔的红细胞将成明显的纽扣状沉到 孔底
抗原回归试验
1、4×单位抗原配制 血凝价数除以4，如表一
256÷4=64，即 1毫升（抗原）+63毫升（PBS）即成。 2、4×单位抗原验证 配制好后和每天应用前都必须对
4×单位抗原进行测试验证，操作按表二进行。 3、作两排孔第1-5孔加PBS液25ul 4、第1孔加4×单位抗原液25ul，吹吸10-15次混匀吸取
简介
• 血凝实验（HA）-血凝抑制（HI）实验是目 前WHO进行全球流感监测所普遍采用的实 验方法。
• 可用于鉴定所有的流感病毒分离株 • 可用来检测家禽血清中的感染或免疫抗体 • 本实验室常采用HA-HI实验检测禽血清中的
免疫抗体
实验的原理、用途
• 用已知抗原测抗体：抗体可以抑制抗原凝 集红细胞。
3、pH7.2、0.01mol/L PBS的配制
a) 配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）和
0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）加蒸馏水至100mL。 b) 配制1×PBS：量取40ml25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至 1000mL。 c) 用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。 d) 灭菌或过滤。 e) PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。
PBS对其它酸碱物质具有一定的缓冲能力，维持反应所需的pH， 因而比使用生理盐水的效果好。
仪器及诊断液等的准备
96孔V型微量血凝集反应板、微量吸液器、混合振荡器、恒温培养 箱、待检血清、鸡新城疫标准阳性血清和阴性血清、 pH7.2、0.01mol/L PBS 、1％鸡红细胞悬液。
稀释禽流感病毒H5亚型抗原：用注射器吸取本抗原规定剂量加入 PBS液稀释好备用。
稀释禽流感H5亚型标准阳性血清：用注射器吸取本血清规定剂量加 入PBS液稀释好备用。
待检血清要新鲜、无杂质、无红细胞、不腐败，盛血清的容器要清
洁。
注意：所有试剂及待检血清在试验前必须恢复室温，且室内温度保持在 （20-25 ℃）
血凝（HA）试验
• 抗原效价的测定
1. 在微量反应板的1孔~12孔均加入25ulPBS液，换滴头。 2. 吸取稀释禽流感病毒H5亚型试验抗原25ul加入第1孔，吹
血凝试验（抗原效价的测定）操作表
孔号
1
2
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4
5
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7
8
9
wk.baidu.com
10
11
12
病毒稀释 度
1:2
1:4
1:8
1:16 1:32 1:64
25 25
PBS液
25 25
25 25
1: 128
1:256
1: 512
25 25 25
1: 1024
1:2048 对照
25
25 25
病毒液 25 25
25 25
25
25 25 2 5
0.25 1:32
做两排 25 25 25
25
25
高致病性禽流感血凝（HA)和 血凝抑制试验（HI）
庆城县疫病预防控制中心
简介
• 禽流感（AD）是有正黏病毒科A型禽流感病毒中 有致病性的任何一型毒株引起以禽类为主的烈性 传染病。我国将其列为一类动物疫病。
• 流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，可以识 别并吸附于红细胞表面受体的结构，出现血凝现 象。但是当病毒悬液中加入特异性抗体，且该抗 体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素与红细胞表 面受体相结合，则红细胞表面的受体就不能与病 毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞凝集现 象就被抑制，称为血凝凝集抑制(HI)反应。
洗涤红细胞 将离心管中的血液经过1500-1800r\min离心8分钟， 弃去上清液，在沉淀物中加入本实验要求的PBS液，轻轻混匀，以均匀 沉淀的红细胞，在经过1500-1800r\min离心8分钟，用吸管移去上清液 及沉淀的红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后， 4℃保存 备用。
1%鸡红细胞悬液制备 用微量移液器取洗涤后的红细胞沉淀泥0.1ml，加入到9.9ml本实验 要求的PBS液，轻轻混匀，制成1%鸡红细胞悬液，备用。
吸取10~15次混匀。 3. 从第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔，吹吸同样次
数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11 孔，从第11孔吸取25ul弃之，换滴头。 4. 每孔再加入25ulPBS。 5. 每孔均加入25ul1%RBC液。 6. 振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察结果。 7. 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌。 完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝 单位。
阿氏液主要用于保存红细胞，在4℃的环境下，红细胞可以保存2 周而不改变活性和特性。因此阿氏液用于采血、保存和运送红细胞进 行化验。
2、1%鸡红细胞悬液制备
采血 用注射器吸取阿氏液1ml，取至少3只SPF公鸡或无禽流感和 新城疫等抗体的健康公鸡的血液3-4ml，与等量的阿氏液混匀，装入离 心管中备用。
第2孔用同样次数吹吸混匀吸取25ul加入到第3孔，如 此进行到第5孔弃去25ul，换滴头。 5、每孔再加入25ulPBS。 6、每孔均加入25ul1%RBC液。 7、振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察 结果。
血凝试验（抗原效价的测定）操作表
孔号
12
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病毒稀释 度
2*
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0.5
• 用来检测禽流感疫苗免疫水平
实验准备工作
试验用溶液的配制
1、鸡红细胞保存液（阿氏Alsevers液)配制 阿氏液（Alsever's Solution）是一种红细胞保存液，含有抗凝剂
柠檬酸钠和细胞需要的养分葡萄糖。 葡萄糖--- 2.05克 柠檬酸钠-- 0.8克 柠檬酸-- 0.055克 氯化钠 ---0.42克
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1%红细胞
微型振荡器1min，静置30min
结果观察
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抗原效价的测定结果判定
1、红细胞100%凝集的抗原最高稀释度为血 凝价。 2、“++++”为100%凝集，“++”为不完全 凝集，“—”为不凝集 3、上表例抗原血凝为256 4、对照孔的红细胞将成明显的纽扣状沉到 孔底
抗原回归试验
1、4×单位抗原配制 血凝价数除以4，如表一
256÷4=64，即 1毫升（抗原）+63毫升（PBS）即成。 2、4×单位抗原验证 配制好后和每天应用前都必须对
4×单位抗原进行测试验证，操作按表二进行。 3、作两排孔第1-5孔加PBS液25ul 4、第1孔加4×单位抗原液25ul，吹吸10-15次混匀吸取
简介
• 血凝实验（HA）-血凝抑制（HI）实验是目 前WHO进行全球流感监测所普遍采用的实 验方法。
• 可用于鉴定所有的流感病毒分离株 • 可用来检测家禽血清中的感染或免疫抗体 • 本实验室常采用HA-HI实验检测禽血清中的
免疫抗体
实验的原理、用途
• 用已知抗原测抗体：抗体可以抑制抗原凝 集红细胞。
3、pH7.2、0.01mol/L PBS的配制
a) 配制25×PB：称量2.74g磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）和
0.79g磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）加蒸馏水至100mL。 b) 配制1×PBS：量取40ml25×PB，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至 1000mL。 c) 用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。 d) 灭菌或过滤。 e) PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。
PBS对其它酸碱物质具有一定的缓冲能力，维持反应所需的pH， 因而比使用生理盐水的效果好。
仪器及诊断液等的准备
96孔V型微量血凝集反应板、微量吸液器、混合振荡器、恒温培养 箱、待检血清、鸡新城疫标准阳性血清和阴性血清、 pH7.2、0.01mol/L PBS 、1％鸡红细胞悬液。
稀释禽流感病毒H5亚型抗原：用注射器吸取本抗原规定剂量加入 PBS液稀释好备用。
稀释禽流感H5亚型标准阳性血清：用注射器吸取本血清规定剂量加 入PBS液稀释好备用。
待检血清要新鲜、无杂质、无红细胞、不腐败，盛血清的容器要清
洁。
注意：所有试剂及待检血清在试验前必须恢复室温，且室内温度保持在 （20-25 ℃）
血凝（HA）试验
• 抗原效价的测定
1. 在微量反应板的1孔~12孔均加入25ulPBS液，换滴头。 2. 吸取稀释禽流感病毒H5亚型试验抗原25ul加入第1孔，吹
血凝试验（抗原效价的测定）操作表
孔号
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病毒稀释 度
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PBS液
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高致病性禽流感血凝（HA)和 血凝抑制试验（HI）
庆城县疫病预防控制中心
简介
• 禽流感（AD）是有正黏病毒科A型禽流感病毒中 有致病性的任何一型毒株引起以禽类为主的烈性 传染病。我国将其列为一类动物疫病。
• 流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，可以识 别并吸附于红细胞表面受体的结构，出现血凝现 象。但是当病毒悬液中加入特异性抗体，且该抗 体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素与红细胞表 面受体相结合，则红细胞表面的受体就不能与病 毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞凝集现 象就被抑制，称为血凝凝集抑制(HI)反应。
洗涤红细胞 将离心管中的血液经过1500-1800r\min离心8分钟， 弃去上清液，在沉淀物中加入本实验要求的PBS液，轻轻混匀，以均匀 沉淀的红细胞，在经过1500-1800r\min离心8分钟，用吸管移去上清液 及沉淀的红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后， 4℃保存 备用。
1%鸡红细胞悬液制备 用微量移液器取洗涤后的红细胞沉淀泥0.1ml，加入到9.9ml本实验 要求的PBS液，轻轻混匀，制成1%鸡红细胞悬液，备用。
吸取10~15次混匀。 3. 从第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔，吹吸同样次
数混匀后吸取25ul加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11 孔，从第11孔吸取25ul弃之，换滴头。 4. 每孔再加入25ulPBS。 5. 每孔均加入25ul1%RBC液。 6. 振荡混匀，在室温（20℃~25℃）静置40min后观察结果。 7. 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流淌。 完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝 单位。