电化学发光PCR技术检测转基因植物
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩 增,因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
*已获得专利许可
42
Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除(Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因,该基因在启动子的作用下,可根据科学家的 意愿,在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉,从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因,或将外来基因从 人们所需食用的部分(如植物的茎、叶、块茎) 彻底清除掉,达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的,从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法*(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法* • MAT(Multi-auto transformation)法* • 替代法*
实验4转基因植物PCR基因扩增及电泳检测
实验4转基因植物PCR检测四、转基因植物PCR基因扩增及电泳检测一、实验目的1.学习转基因植物PCR基因扩增的基本原理。
2.掌握转基因植物PCR基因扩增的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、原理PCR检测技术的基本原理是根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物,经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大,最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无,从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分进行判定。
由于目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV35S启动子和NOS终止子这两种基因表达调控序列或其中之一,而CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列早已公开。
故在对食品样品的转基因背景一无所知的情况下,根据CaMV35S启动子和NOS终止子的DNA序列设计合适引物,通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV35S启动子和NOS终止子基因序列,来判定该食品是否为转基因食品。
三、试验材料提取的甘薯基因组DNA。
四、试剂4.1 PCR反应引物序列35S:5,-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3,//5,-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3,;NOS:5,-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TC-3,//5,-TTA TCC TAG TTT GCG CGC-3,。
4.2 PCR反应试剂:无菌去离子水;模板DNA;20 μmol / LPCR 引物;5U/μL Taq DNA 聚合酶;2.5 mmol / L dNTPs;10×PCR 缓冲液;25 mmol / L MgCl2,25 mmol / L KCl , 20 μg / mL 灭菌无核酸酶的牛血清白蛋白4.2 核酸电泳相关试剂(见实验6)五、仪器5.1 PCR扩增仪。
5.2 微量移液器。
5.3 吸头。
5.4 电泳仪。
5.5 电泳槽。
5.6 凝胶成像仪。
5.7 PCR管。
六、实验步骤6.1 转基因植物PCR基因扩增6.1.1.1 按待检样品数(每一个样品分设35S和NOS两个检测反应)并加空白对照、阴性对照、阳性对照,取一定数量的无菌无污染的洁净干燥PCR管,按下表用记号笔在管壁上编号:6.1.1.2 之后按上述顺序依次加入各PCR反应液。
实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用_敖金霞
实时荧光定量PCR 技术在转基因检测中的应用收稿日期:2008-03-05基金项目:东北农业大学创新团队项目(CXT004-3-2)作者简介:敖金霞(1977-),女,黑龙江人,博士研究生,助研,主要从事转基因作物基因检测技术方面研究。
*通讯作者:教授,博士生导师,E-mail:gaoxj5390@敖金霞1,高学军1*,仇有文1,郭士成2(1.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,农业部转基因生物产品成分监督检测测试中心,哈尔滨150030;2.东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030)摘要:实时荧光定量PCR 技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。
随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。
实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR 反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR 逐步成为转基因检测的重要工具。
关键词:实时荧光定量PCR ;Taq Man 探针法;SYBR Green I 染料法;转基因检测中图分类号:TS207.3文献标识码:A随着有关转基因成分标签法的建立和对于转基因食品的重视程度及量化要求的提高,定性PCR 因其在转基因检测中的高敏感性差易造成假阳性现象,以及操作误差和一些反应抑制因素带来的假阴性现象,使其已经不能再满足人们的需要。
在这种基础之上实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction ,RQ-PCR )发展起来,RQ-PCR 技术不仅实现了对DNA 模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
目前实时荧光定量PCR 已广泛应用于分子生物学、农业、医学等学科的应用和基础研究领域,并已经在转基因检测中发挥了不可替代的作用[1-2]。
1R Q -PC R 的基本原理实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线,对待测样品中的未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 (1)
测内源特异参照基因 (内源基因) ,可以判定
DNA 是否被提取出来 ,或所提 DNA 是否适
合于进行 PCR 扩增 ,从而可以避免检测结果
的假阴性 。因此 ,对大豆内源基因 Lectin[5 ]
的检测即是对被检测样品 DNA 提取质量的
检测 。
本研究通过采用特异引物首先对转基因
大豆中的内源基因进行了定性 PCR 检测 ,以 确定所提取的 DNA 是否适合于 PCR 扩增 。 PCR 电泳显示 :转基因成分含量分别为 5 %、 2 %、1 %、015 %、011 %、0 %的转基因大豆 ,均 扩增出了 118 bp 片断 (电泳结果未显示) ,该 结果表明 ,所提取的 DNA 数量和质量均适 合于 PCR 扩增 。 212 标准曲线的建立
2 结果与分析
Y = - 31176 X + 261006 , 相 关 系 数 R2 为 01991 。这样 ,将待测样品扩增得到的 Ct 值
211 大豆内源 Lectin 基因定性
( Y 值) 代入公式 ,即可得到待测样品的转基
提取出一定数量的高质量 DNA 是进行 因成分的百分含量 。
转基因成分 PCR 检测的前提条件 。通过检
015 %、011 %、0 % 的 转 基 因 大 豆 Roundup
大豆内源基因 Lectin 检测的引物如表 1
Ready 标准品购自 Fluka 公司 ( Fluka ,Buchs , 所示 ,反应在 50μL 的反应体系中进行 ,其中
Switzerland) 。
PCR 反应缓冲液 5μL , 脱氧核苷酸三磷酸
66
Ready 转 基 因 大 豆 标 准 品 ( 5 %、2 %、1 %、 015 %、011 %、0 %) 的测定 ,计算机自动生成 标准曲线 ,纵坐标为临界循环值 Ct ,横坐标 为百分含量 。根据标准曲线所得的线性计算 公式 ,将样品的 Ct 值代入公式 ,即可得到待 测样品的转基因成分的百分含量 。 1121412 检测低限的测定
转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南
转基因植物及其产品成分检测环介导等温扩增方法制定指南1. 引言1.1 概述本篇文章旨在介绍转基因植物及其产品成分检测中的一种重要方法——环介导等温扩增,并制定相关操作指南。
转基因植物技术是现代生物技术领域的一个重要研究方向,通过引入外源基因改变植物的遗传特性,以实现对植物性状和品质的调控。
然而,随着转基因植物产品在市场上的广泛应用,对其合规性和安全性的检测也愈发重要。
目前,PCR技术是最常用于转基因植物及其产品成分检测的方法之一,但存在耗时长、复杂度高等问题。
相比之下,环介导等温扩增作为一种新兴的核酸扩增方法,在特异性、快速性、简便性以及成本效益上具有明显优势。
本文将详细介绍环介导等温扩增原理并制定相应操作指南,以期为广大科研工作者提供实验操作参考。
1.2 转基因植物简介转基因植物是通过人为手段将外源基因导入自然界中不存在的植物基因组中而产生的植物。
这些外源基因通过转化技术嵌入到植物细胞中,被遗传到下一代,并在整个生长过程中被表达出来。
转基因植物技术在农业、医药等领域具有广泛的应用前景,例如提高抗病虫害能力、改善产量和品质等。
然而,鉴别转基因植物及其产品成分的重要性日益凸显。
政府和国际组织对转基因食品进行严格管理与监控,以确保消费者的食品安全和权益。
因此,在有关立法和标签法规的约束下,开发可靠快速的检测方法是十分必要的。
1.3 环介导等温扩增方法简介环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)作为一种新兴的核酸扩增方法,由于其高度特异性、高效率、简单操作以及成本效益受到了广泛关注。
该方法利用DNA引物和Bst DNA聚合酶在等温条件下完成扩增反应,无需复杂设备与复杂试剂制备流程,大大降低了实验操作的难度。
环介导等温扩增方法通过特异性引物对目标序列进行扩增,将其从复杂样本中快速准确地检测出来。
该方法具有传统PCR技术无法比拟的优势,如高特异性、高灵敏度、快速反应速度和便捷实施等。
PCR技术在食品药品检测中的应用
PCR技术在食品药品检测中的应用PCR(聚合酶链式反应)技术是一种基于DNA复制的核酸分子生物学技术,常常用于食品药品检测中。
PCR技术可以快速、准确地检测出微量的DNA序列,具有高灵敏度和高特异性,在食品药品的品质控制和安全检测中起着重要的作用。
在食品检测中,PCR技术常用于鉴定食品中是否含有转基因成分、危害性微生物以及食品的真实性。
通过检测食品中的DNA序列,可以快速、准确地确定食品的成分和真实性,保证食品的质量和安全。
对于转基因食品,PCR技术可以检测到其中的外源基因,确定食品是否含有转基因成分;对于海鲜产品,PCR技术可以检测其中的DNA序列,确定其真实品种,避免虚假标注。
在药品检测中,PCR技术经常用于检测药品中的微生物污染和目标基因的表达。
在药品生产过程中,微生物的污染可能会导致药品的质量下降甚至失去治疗效果,因此需要对药品中的微生物进行检测。
PCR技术可以快速、准确地检测药品中的微生物,避免药品污染对人体健康造成的危害。
对于某些药物,如抗癌药物,其治疗效果与目标基因的表达水平有关。
PCR技术可以定量检测目标基因的表达水平,帮助评估药物的疗效,指导临床应用。
与传统的检测方法相比,PCR技术具有许多优势。
PCR技术可以在较短的时间内得出结果,通常只需要几个小时就可以完成一次检测。
PCR技术具有高灵敏度,可以检测到非常低浓度的目标物质。
PCR技术还具有高特异性,可以区分目标物质和其他干扰物质。
PCR技术的结果可以通过数字化方式直接显示,便于结果的分析和解读。
PCR技术在食品药品检测中也存在一些局限性。
PCR技术不能区分活体和死体的DNA,可能会引入误判。
PCR技术对样品的质量和纯度要求较高,其中的杂质和抑制物可能会干扰PCR反应的进行。
PCR技术在检测复杂样品时可能会受到样品的稀释效应和非特异性扩增的影响。
PCR技术在食品药品检测中具有广泛的应用前景。
随着技术的进一步发展,PCR技术将更加高效、快速、准确地检测食品药品中的目标物质,为食品药品的品质控制和安全检测提供有力支持。
PCR法测定转基因植物食品及掺假食品研究
PCR法测定转基因植物食品及掺假食品研究通过对我国目前食品行业中的问题以及对PCR法测定转基因植物食品以及检测掺假食品的研究现状的分析,提出我国目前食品质量监督部门应推广采用已成熟的基因检测技术,用于食品质量检测,打击假冒伪劣产品,维护消费者利益。
标签:PCR法;转基因植物食品;掺假;食品质量监督1我国目前食品行业中的问题植物基因工程如果从上世纪70年代处建立重组DNA技术开始,已有30多年的历史,目前世界上转基因植物多达一百多个物种,有近千例转基因植物被批准进入田间试验,其中有许多转基因产品已经通过商业开发进入国际市场。
近年来,我国粮食呈净进口格局,2004年-2006年3年累计净进口1450亿斤,平均每年净进口500亿斤,其中就有相当部分含有转基因成分。
转基因的高生产力、高品质性和高抗逆性,是传统品种无法比拟的,在人口、环境的压力下,转基因产品仍将具有较大的市场空间。
由转基因食品市场化引发的安全问题也越来越成为人们关注的焦点。
同时,伴随着我国食品工业的飞速发展,不法分子的掺假方式越来越多、范围越来越广、内容越来越复杂。
掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒、粉饰等手段。
掺假范围可涉及粮油、肉类和加工制品、乳制品、果蔬、糖及糖制品、饮料类等各领域。
掺假的例子不胜枚举。
粮食中常见的掺假为新米掺入陈米、廉价的米混入价高的米、面粉中混入滑石粉等。
据检查发现食用植物油中花生油和芝麻油的掺杂、掺假尤为严重。
食用植物油中可能会掺兑地沟油以及其他非食用油(如桐油、青油、蓖麻油、巴豆油、矿物油等),出售牟取非法暴利,严重影响了消费者的健康。
掺假香油主要是掺兑水、冬瓜汤、米汤、猪油、棉籽油、菜籽油或其他的油等,有的香油是由色拉油与香油精勾兑的。
掺假麻酱是用炒过的莜面粉再加上色拉油配制而成的。
尤以私营企业及地方小油料加工厂的散装粮油以及小的粮油店掺假现象较为严重。
鲜奶以及其他奶制品掺假行为也十分猖獗,除2008年的“三鹿事件”引发的奶制品产业的“大地震”之外,仍存在其他的掺豆浆、淀粉和米汁、植物蛋白现象。
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)
如何确定转基因拷贝数(Southern Blot法和荧光定量PCR方法)发布: 2010-01-22来自: 易生物实验阅读数:5391次鉴定转基因植物的第一步就是要确定被转基因已经稳定的整合到了染色体上。
第二步任务就是评估有多少个转基因拷贝,以及每个转基因的表达水平如何。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后,即获得T 0 代转基因植物。
在转化过程中,外源DNA 随机插入植物内,插入的拷贝数和位点都不固定。
插入外源基因的拷贝数低(1或2个)能较好的表达,插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象。
因此,检测T0代植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
1、Southern Blot法Southern Blot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA 样品固定在固相载体(硝酸纤维膜或尼龙膜)上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA 的位置上显示出杂交信号,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量,从而计算出转入的拷贝数。
Southern法准确性高、特异性强,但存在费时费力的缺点。
另外,由于Southern法检测不经过靶片段的扩增(PCR),一般每个电泳通道需要10-30 μg的DNA ,在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱,不宜大量取样。
如果外源基因在插入时发生基因重组,造成限制性酶切位点丢失,Southern 法也无法检测到。
这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。
2、荧光定量PCR方法利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。
实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。
其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如:SYBR GREEN I)或特异性的荧光探针(如:Taqman 探针),实时检测荧光量的变化,获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数:CT值(Cycle Threshold);通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线,就可以准确定量样品的浓度。
实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆
实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆朱德斌;邢晓波【摘要】A real-time fluorescence quantitative PCR method was developed to detect genetically modified ( GM ) soybean using SYBR Green I,a double-stranded DNA-selective fluorescent dye. Special primers were used to amplify 35S promoter that was often used in GM soybeans. The fluorescence of SYBR Green I was used to monitor the quantity of PCR product. The results show that the detection limit for 35S promoter is 0. 005 nmol/L and the linear range is more than three orders of magnitude. The GM soybean and the non-GM soybean can be clearly discriminated. Thus, the method may become a convenient tool for daily GM food detection due to its rapidness, simplicity, sensitivity, safety, high throughput and low cost.%针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR Green Ⅰ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测.该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2012(021)003【总页数】4页(P279-282)【关键词】实时荧光定量PCR;转基因大豆;35S启动子【作者】朱德斌;邢晓波【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q78随着近年来人们对转基因产品(genetically modified organism,GMO)安全性的日益重视,GMO标识已成为各国GMO监管的重要部分。
实时荧光定量PCR技术在转基因玉米检测中的应用研究
V ol.30,N o.6pp.602~607 June ,2004作 物 学 报ACT A AG RONOMICA SI NICA第30卷第6期2004年6月 602~607页实时荧光定量PCR 技术在转基因玉米检测中的应用研究陈 颖1,3 徐宝梁1 苏 宁1 葛毅强2 王曙光1Ξ(1中国进出口商品检验技术研究所,北京100025;2科技部中国农村技术开发中心,北京100045)摘 要 采用实时荧光定量PCR 技术,通过使用特异的引物和探针,对玉米中的内源基因Invertase 和转基因玉米M on810、Event 176中的外源基因进行了定量检测,建立了商业化转基因玉米M on 810(Y ieldG ard )和Event 176(Maximizer )的定量PCR 检测方法。
该方法的检测灵敏度小于0.01%,是国际上设定的转基因最低限量的100倍。
关键词 定量PCR 技术;转基因玉米M on 810(Y ieldG ard );转基因玉米Event 176(Maximizer );转基因检测中图分类号:S513R eal 2time Q uantitative PCR Detection of G enetically Modified Maximizer ○RMaizeand YieldG ard ○RMaizeCHE N Y ing 1,3,X U Bao 2Liang 1,S U Ning 1,GE Y i 2Qiang 2,W ANG Shu 2G uang 1(1China Import and Export Commodity Inspection Technology Institute ,Beijing 100025;2China Agricultural Technology Development Centre ,Beijing 100045,Chi 2na )Abstract A reliable and sim ple Real 2time quantitative polymerase chain reaction method for detection of genetically m odi 2fied maize with ABI Prism 7700was established in this paper.A set of PCR primers and probes was designed specific to transgenic commercial maize M on 810and Event 176.The detection lim it is less than 0.01%which is 100times lower than labeling threshold of European Union.K ey w ords Real 2time quantitative PCR ;Y ieldG ard ○RMaize M on 810;Maximizer ○RMaize Event 176;GM O detection G M O (G enetically M odified Organism )食品对人类健康及生态环境的潜在影响日益受到关注,转基因产品标识已成为各国转基因产品监管的重要部分。
实验五转基因植物的检测
30Cycles
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目前研究转基因植物外源基因转 录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR (RNA )
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结果与分析
❖ 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录; ❖ 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电
实验材料、设备及试剂
1、材料: 转基因植物的RNA或mRNA制备物。
非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物 2、设备:PCR仪、移液器、PCR管等。 3、试剂:10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物(随
机引物,Oligo dT; 特异引物)、 10×One Step RNA PCR Buffer、25 mM MgCl2、10 mM dNTP、RNase Inhibitor (40 U/μl)、AMV-Optimized Taq1 μl、 AMV RTase XL (5 U/μl)、上游特异Primer (20 μM)*1、下游特异Primer (20 μM)*2、RNase Free H2O。
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实验一、质粒三种提取方法的比较
为什么要用对数期的菌液提取质粒 ? 因为对数期菌的 生长状况和数量最佳,有利于提取质粒 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用? ❖ 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl,pH=8.0
❖ 葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA 抑制DNase的活性。 这一步溶液中还可以加入RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去
转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测
转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测芦春斌【摘要】转基因(植物)食品的安全性是科学界及公众普遍关心的问题.在转基因植物研究中,根据转基因植物所带有的转基因成分的DNA序列,设计引物对耐草铵膦转基因植物中转入的转基因成分进行了PCR分析,结果表明,采用PCR扩增对外源基因和遗传标记基因的分析方法灵敏、准确.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2006(025)001【总页数】3页(P1-3)【关键词】草铵膦耐性;转基因成分;PCR分析【作者】芦春斌【作者单位】暨南大学生殖免疫中心,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q94转基因植物技术是将抗除草剂基因、抗病毒基因、抗虫基因等各种优良性状基因等遗传物质片段,导入植物中使其具备新的生物性状[1~5]的技术。
目前国内外已经得到100种以上转基因植物,其中玉米、大豆和棉花等转基因作物已经在世界各地大面积种植,其推广及种植对世界和我国的农业已做出很大的贡献。
长期以来,国际上都存在着转基因植物对人体和环境安全的争论。
欧美、日本、澳大利亚、俄罗斯、新加坡等已经设立专门机构,对每一项转基因的田间试验和成果发放进行逐个的审批,以立法或其它形式要求对转基因产品加贴标签,供消费者购买时参考,或以其它方式限制转基因产品的进口。
而我国检验检疫系统由于没有对转基因产品进行检测的统一标准,许多国外转基因产品没有检测直接进入我国,严重危害我国食品安全问题,也侵犯了公众的知情权和选择权。
近年来我国的大豆进口数量逐年增加,从2000年进口大豆1 040万t激增至2003年的2 000万t,而国产大豆产量约1 600万t。
根据美国有关的数据显示,销往中国的大豆占其总销售额的三分之一以上,而70%的美国大豆是转基因大豆。
转基因大豆大量进口直接影响我国的农产品生产发展,也影响国家经济利益和食品安全。
国务院于2001年5月发布了《农业转基因生物安全管理条例》,规定了在中国境内销售列入农业转基因生物目录的农业转基因生物,应当有明显的标识。
高灵敏度电化学发光方法在植物病毒和转基因物种检测中的应用的开题报告
高灵敏度电化学发光方法在植物病毒和转基因物种
检测中的应用的开题报告
研究背景
植物病毒和转基因物种的检测一直是植物病理学和生物技术领域的
研究热点。
传统的检测方法包括PCR、酶联免疫吸附试验等,但这些方
法具有操作繁琐、耗时长、需要特殊设备等不足之处。
随着技术的不断
进步,高灵敏度电化学发光方法被引入到植物病毒和转基因物种检测中,具有操作简单、快速、高灵敏度等优势。
因此,研究高灵敏度电化学发
光方法在植物病毒和转基因物种检测中的应用具有重要意义。
研究内容
本文拟研究高灵敏度电化学发光技术在植物病毒和转基因物种检测
中的应用。
具体包括以下研究内容:
1. 根据目标检测物种设计适当的引物、探针和电极;
2. 优化反应条件,包括电极材料、电化学溶液、反应时间等;
3. 确定检测标准,包括灵敏度、特异性和稳定性;
4. 利用编码基因等方法提高多目标检测效率;
5. 应用该方法进行植物病毒和转基因物种检测,并与传统方法进行
比较。
预期成果
本研究预期能够建立一种基于高灵敏度电化学发光技术的植物病毒
和转基因物种检测方法,具有操作简单、快速、高灵敏度、高特异性等
优势。
该方法可应用于植物病毒和转基因物种的快速筛选和检测,有望
实现在植物病毒和转基因物种研究中的广泛应用,具有重要的科学价值
和实际应用价值。
以实时荧光定量PCR 技术检测转基因玉米MON8801
1.4
标准曲线制作 将已知浓度的标准分子经系列稀释 , 制备成不同浓
度的标准品 , 稀释液为 TaKaRa 公司的 TB 溶液。首先将 已知浓度的标准分子溶液稀释成 1.0×1013 拷贝 μL1, 取 100 μL 上述标准分子溶液加入 900 μL TB 溶液稀释 , 充分 混匀 , 再次取其混合液 100 μL 加入 900 μL TB 溶液稀释 , 充分混匀 , 其他浓度依次等比稀释。稀释后的标准分子浓 度分别为 1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102 拷 贝 μL1, 每个浓度重复 4 次 , 分别以内标准基因和特异性 序列引物及探针进行实时定量 PCR 反应 , 以拷贝数的自 然对数值为横坐标 , 以 Ct 值 (荧光值达到指定阈值时的循 环次数 ) 为纵坐标 , 绘制内标准基因和特异性序列标准曲 线 , 并求解回归方程。实时荧光定量 PCR 所用的内标准 基因及特异性序列引物及探针见表 1。 反应体系 (50 μL)含 2×Premix Ex Taq 25 μL, forward primer (10 μmol L1) 2 μL, reverse primer (10 μmol L1) 2 μL, TaqMan probe (10 μmol L1) 2 μL, 50×ROX Reference Dye 1 μL, DNA 模板 2 μL, ddH2O 16 μL。扩增反应条件为 95℃预变性 30 s; 95℃变性 5 s, 60℃退火 /延伸 30 s; 共计 40 个循环。 1.5 待测样品 MON88017 转基因成分含量测定 分别以内标准基因和特异性序列进行 5 个待测样品 实时荧光定量 PCR 反应 , 根据标准曲线检测得到 5 个含 量不同的待测样品 Ct 值, 分别计算出内标准基因和侧翼序 列的拷贝数 , 根据以下公式计算出待测样品中 MON88017 成分含量。 转基因成分含量计算公式为转基因 Mon88017 含量 = 外源期刊拷贝数 /内标准基因拷贝数 ×100%。
抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测
应用与环境生物学报 2009,15 ( 6 ): 866~870Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00866随着转基因技术的日趋成熟,各种转基因农作物由实验室走向环境释放,其中不少农作物已进行商品化生产,且种植面积急剧扩大. 根据国际农业生物技术应用咨询服务中心(ISAAA )2007年的报告,95%的转基因农作物集中在大豆、玉米、棉花和油菜籽4种植物上,抗各种杂草和抗虫害的两个转基因类型占主导地位. 由此带来的转基因生物及产品的安全性问题已经成为人们讨论的热点问题. 世界多数国家和国际组织的普遍做法是对转基因产品实施标识管理,大部分实施转基因产品标识管理政策的国家都规定了各自不同的标识阈值. 例如:欧盟(2002)规定转基因产品成分高于0.9%,巴西为4%,澳大利亚和新西兰为1%,俄罗斯、中国香港和中国台湾地区都为5%时,就必须进行标识. 我国2001年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》,其中第四章第二十八条明确规定,在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物,应当有明显的标识. 因此,为转基因产品实施标签制度的定量检测技术显得尤为重要.近年来,对转基因生物产品进行定量分析的主要方法是荧光定量PCR 技术. 由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR 相比,具有特异性强和灵敏度高的特点,避免了PCR 产物进行后期处理,克服了以往PCR 技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点[1],极大地提高了检测速度和自动化程度. 荧光定量PCR 技术是指在普通PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累监测整个PCR 反应的进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法. 荧光定量PCR 的荧光基团包括探针类和染料类两种. 本文所用染料类如SYBR Green I 是一种非饱和菁类荧光素,利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加,其处于游离状态时,检测不到荧光信号,当结合dsDNA 后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到,荧光强度的增加与初始模板量相关. 目前实时荧光定量PCR 中抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测*王恒波 陈如凯 陈平华**(福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室 福州 350002)Detection of Genetically Modi fi ed Herbicide–tolerant Crops by Real-timeFluorescent Quantitative PCR Assay*WANG Hengbo, CHEN Rukai & CHEN Pinghua **(Key Laboratory of Genetic Improvement for Sugarcane, Ministry of Agriculture, Sugarcane Research Institute ofFujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002, China )Abstract A rapid and sensitive SYBR Green I-based real-time PCR method was developed for quantitative detection of CP4-EPSPS and PAT genes from the genetically modi fi ed (GM) herbicide-tolerant crops. The target genes from transgenic soybean and maize references were ampli fi ed to make standard curves. The transgenic ratios were then calculated according to the standard C t -copies linear graphs of these two genes. The reproducibility and melting curves of the genes were also analyzed. The results showed that the standard equations of CP4-EPSPS and PAT genes had higher R 2 values of 0.993 9 and 0.992 4, respectively. The difference in transgenic ratios between the known standards and measured crops was only 6.52%~7.90%. These results suggest that the real-time PCR assay with SYBR Green I dye is suitable for detecting the ratios of GM crops and their derivates. Fig 5, Tab 2, Ref 11 Keywords genetically modi fi ed herbicide-tolerant crop; SYBR Green I dye; real-time fl uorescent quantitative PCR; meltingcurve; detection CLC Q943.2摘 要 建立了一种以SYBR Green I 为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR 方法. 以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green I 结合染料实时荧光定量PCR 技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析. 研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好,R 2值分别达到0.993 9与0.992 4. 通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%. 结果表明,SYBR Green I 结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR 检测. 图5 表2 参11关键词 抗除草剂转基因作物;SYBR Green I 荧光染料;实时荧光定量PCR ;溶解曲线;检测CLC Q943.2收稿日期:2008-12-15 接受日期:2009-03-17*国家“863”计划项目(No. 2007AA100701)和福建省科技计划重点项目(No. 2007I0036)资助 Support by the National “863” Project of China (No. 2007AA100701) and the Major Research Projects of the Department of Science & Technology of Fujian, China (No. 2007I0036)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: phcemail@)867 6 期王恒波等:抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测使用特异性的荧光探针较多,但由于反应体系中荧光探针能与靶序列特异性杂交,同时存在猝灭不彻底、合成和标记复杂、成本较高等缺陷[2~4]. SYBR Green I荧光染料成本较低,但尚未在定量检测转抗除草剂基因作物中应用. 为了降低检测成本,本研究利用SYBR Green I荧光染料代替价格昂贵的TaqMan探针进行定量检测,分别建立了两种商品化程度最高的转基因大豆CP4-EPSSPS和转基因玉米(TC1507)PAT两种抗除草剂基因的定量PCR检测体系,以期为我国转基因定量标识检测体系提供技术支持.1 材料与方法1.1 材 料转基因大豆标准品(Roundup Ready TM soya beans)(ERM-BF410f、ERM-BF410d、ERM-BF410a),其中转基因成分含量分别占5%、1%、0%;转基因玉米标准品(TC1507 Maize),转基因成分含量分别占0%、1%、10%,以上标准品均由国际标准物质收藏中心(IRMM)制备,均购自Fluka公司. 阴性对照材料大豆为鲁豆4号、玉米吉单275,系本实验室保存.1.2 酶及试剂PCR反应试剂(包括ExTaq酶、SYBR Premix ExTaq、dNTPs、buffer)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司;CTAB提取液[200 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L NaCl,25 mmol/L EDTA,0.5% SDS,pH 8.0];沉淀缓冲液[2% CTAB,100 mmol/ L Tris-HCl,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,1% PVP];100 μg/mL蛋白酶K;酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1);氯仿 : 异戊醇(24 : 1);异丙醇;75%乙醇.1.3 主要仪器定量PCR仪:美国BIO-RAD公司生产;离心机:德国Eppendorf 5810型;PCR仪:德国Eppendorf公司Master Cycler gradient 96;核酸蛋白分析仪:瑞典APBiotech产品;生物安全柜:上海力新有限公司.1.4 PCR引物引物由上海生工生物工程有限公司合成,其核苷酸序列和扩增片段长度见表1. 引物采用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1195-2003、SN/T1196-2003.1.5 基因组DNA的提取采用SN/T1195-2003标准提取基因组DNA,用核酸蛋白分析仪测定核酸提取液中DNA的浓度,稀释到400 ng/μL 备用. 1.6 定性PCR对内源基因的检测与定量PCR对CP4-EPSPS和PAT外源基因的检测大豆和玉米的内源基因分别是Lectin、IVR,其检测引物如表1中所示,定性PCR反应在25 μL体系中进行. 反应体系:10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,引物(10 pmol/L)各0.5 μL,ExTaq酶(5 U/μL)0.125 μL,模板DNA(100 ng/μL)1 μL,加灭菌双蒸水使总体积为25 μL. 扩增条件为预变性95℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,35个循环;最后72 ℃延伸4 min.采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供的试剂盒,在25 μL的反应体系中进行,其余按照说明书进行. 定量PCR反应条件:50 ℃ 2 min;95 ℃ 5 min;60 ℃ 40 s;40个循环. 反应结束后,记录参照样品和待测样品的Ct值,熔解曲线温度范围设置为65.0 ℃至95.0 ℃,每间隔0.5 ℃读数一次,每次1 s,并且连续记录荧光信号的变化,将温度的变化与荧光信号的变化求负倒数后对温度作图,可得到产物的 Tm值. 除特别注明外,每个试样均做3个重复,并同时设立空白对照和非转基因样品的阴性对照.1.7 DNA模板的制备提取转基因大豆含量(转基因大豆基因组量/大豆总基因组量)为5%的标准参照物质的DNA样品,利用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度,稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、5倍、25倍、125倍制作标准曲线,为了验证生成的标准曲线,特别将浓度为400 ng/μL、1%的转基因大豆标准品作为待测样品. 取不同稀释倍数的DNA待测样品进行实时荧光PCR检测,建立合适的标准曲线,用于待测转基因大豆样品的定量检测. 将转基因玉米TC1507含量为10%的参照物质提取的DNA样品稀释到400 ng/μL. 用双蒸水分别将其DNA稀释1倍、2倍、10倍、50倍、250倍制作标准曲线,用于待测转基因玉米TC1507样品的定量检测.1.8 定量标准曲线的建立和验证及溶解曲线分析通过对模拟不同转基因含量的转基因大豆和转基因玉米样品的测定,计算机自动生成标准曲线,纵坐标为Ct,横坐标为百分含量的对数. 根据回归曲线方程,将样品的Ct值代入公式,即可得到该转基因作物的百分含量.荧光染料的优势在于能检测各种双链DNA序列的扩增,无需设计探针,检测过程简便,成本低廉. 然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合,对DNA模板没有选择性,因此也能与非特异的dsDNA结合,使实验容易产生假阳性信号,目前引物二聚体的问题可以通过溶解曲线分析加以解决.表1 大豆Lectin、玉米IVR内源基因和转化的CP4-EPSPS、PAT基因的PCR引物序列及产物大小Table 1 List of PCR primers designed for Lectin, CP4-EPSPS in RR soybean and IVR, PATin maize TC1507, and the sizes of their products基因 Gene引物序列 Primer sequence产物片段大小 Amplifi ed fragment (bp)Lectin Forward 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’Reverse 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’′118CP4-EPSPS Forward 5’-CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C-3’Reverse 5’-CTT CTG TGC TGT AGC CAC TGA TGC-3’320IVR Forward 5’-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3’Reverse 5’-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3’226PAT Forward 5’-GTC GAC ATG TCT CCG GCG AG-3’Reverse 5’-GCA ACC AAC CAA GGG TAT C-3’19186815 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol1.9 检测方法精密度分析[5]本实验在讨论以上两种标准品的基础上分别选择了3个不同转基因含量的浓度(0.04%、1.00%、5.00%),分别进行10次重复测定,通过统计分析方法计算两者的精密度.2 结果与分析2.1 大豆和玉米DNA的质量及其内源基因的扩增经过核酸蛋白测定仪测定,提取的基因组D N A的D260 nm /D280 nm在1.7~2.0之间,稀释DNA的浓度为400 ng/μL. 提取高质量的DNA是进行转基因成分检测的前提条件. 通过检测内源特异参照基因,可以判定DNA是否被提取出来,或所提DNA是否存在抑制PCR扩增的物质,从而可以避免检测出现的假阴性结果. 首先通过对大豆和玉米基因组中内源单拷贝Lectin基因与IVR基因进行定性PCR检测,验证所提取的基因组DNA能够适合于PCR扩增. 图1、图2分别显示Lectin基因与IVR基因扩增结果,由图可以看出,分别扩增出了预期的118 bp内源Lectin基因片段和226 bp的内源IVR基因片段,表明提取的基因组DNA质量完全符合PCR扩增的要求.2.2 定量标准曲线的建立和验证将转基因大豆含量为5%和转基因玉米含量为10%的DNA标准品,通过5倍稀释模拟5%、1%、0.2%、0.04%不同含量的转基因样品建立标准曲线,将待测样品扩增得到的Ct 值代入公式,即可得到待测样品的转基因成分的百分含量的对数,进而计算转基因成分的含量,最后通过已知百分含量的标准品进行验证所建立的标准曲线是否适合对转基因大豆和转基因玉米TC1507的定量检测. 研究表明:Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[6]. Ct值越小,模板DNA的起始拷贝数越多;Ct值越大,模板DNA的起始拷贝数越少. 图3与图4分别是两个基因实时荧光定量扩增图. 由图可以看出,虽然两个基因的起始含量(大豆为5%和玉米为10%)不同,但是由于拷贝数/基因组的差异,它们在25个循环左右开始进入指数扩增期,且两个基因扩增稳定,浓度较低的样品用较多的循环次数才能产生较高的荧光信号,其Ct值也相应增大.检测转基因大豆得到的标准曲线方程为y = -2.9429x + 20.918,r2 = 0.9939. 其中:x为外源基因的百分含量的对数,y为Ct值,r2为线性相关系数;检测转基因玉米TC1507得到的标准曲线方程为y = -3.4394x + 23.193,r2=0.9924.以上定量PCR检测的标准曲线相关系数达到了0.99以上,具有较好的线性关系和可以接受范围内的SD值,检测灵敏度为0.04%,该灵敏度是目前国际上设定的转基因最低标识限量的25倍,已经完全能满足转基因产品标识检测的需要. 将已知转基因含量的待测样品Ct均值代入方程,得出0.9348%和1.079%,与实际含量的相对偏差是6.52%和7.9%,可以看出,线性方程完全可以满足转基因抗除草剂大豆和玉米的定量PCR检测需要.2.3 溶解曲线分析在SYBR GreenⅠ染料法检测中,染料与所有的双链DNA图1 大豆内源Lectin基因的定性检测 Fig. 1 Qualitative detection of the endogenous gene Lectin of soybean M:100 bp DNA ladder marker(Tiangen);泳道1、2、3为5%转基因大豆标准品;4、5、6为1%转基因大豆标准品;7:阴性对照(pBI121);8:阳性对照(鲁豆4号);9:提取空白对照;10:试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic soybean reference of 5%; Lanes 4,5,6: Transgenic soybean reference of 1%; Lane 7: Negative control (pBI121); Lane 8: Positive control (Ludou No. 4); Lane 9, Environment control; Lane 10: Reagent control图2 玉米内源IVR基因的定性检测Fig. 2 Qualitative detection of the endogenous gene IVR of maizeM:100 bp DNA ladder marke(Tiangen);1、2、3为10%转基因玉米标准品;4、5、6为1%转基因玉米标准品;7:阴性对照(鲁豆4);8:阳性对照(非转基因玉米);9:提取空白对照;10:试剂空白对照M: 100 bp DNA ladder marker; Lanes 1, 2, 3: Transgenic maize reference of 10%; Lanes 4, 5, 6: Transgenic maize reference of 1%; Lane 7: Negative control (Ludou No. 4); Lane 8: Positive control (Jidan No. 275); Lane 9: Environment control; Lane 10: Reagent control图3 转基因大豆标准品CP4-EPSPS基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 3 Quantitative real-time PCR detection of CP4-EPSPS in GM soybeanreferences with SYBR Green I dye图4 转基因玉米TC1507标准品PAT基因SYBR Green I染料荧光定量PCR扩增曲线Fig. 4 Quantitative real-time PCR detection of PAT in GM maize referenceswith SYBR Green I dye8696 期王恒波等:抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR 检测相结合,不需要探针,检测方法简便;但其特异性完全依赖于引物,对引物设计要求特别高. 引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物都将引起假阳性的出现[7],这将严重影响到定量检测的精确性和可靠性. 但利用荧光染料可以指示双链DNA 熔点的性质,通过温度的变化进行熔解曲线(Tm )分析[8],可识别扩增产物和引物二聚体,然后在检测的过程中通过提高退火温度,区分非特异扩增,从而降低非特异产物的影响. 一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性. 理想的熔解曲线应该是单峰型曲线,如果出现两个或两个以上的峰,说明有引物二聚体等非特异性扩增产生. 本实验根据CP4-EPSPS 和Lectin 的扩增产物特点确定的读板温度分别为83.5 ℃和82 ℃,生成的溶解曲线如图5(A 、B ),可以看出,这两个基因的溶解曲线都是单峰型,说明PCR 扩增过程中没有出现非特异性扩增,由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的.2.4 检测方法灵敏度和精密度的分析 对于不同检测方法来讲,其检测的灵敏度在很大程度上决定了检测结果的可信度,尤其是对于特异性不强的SYBR Green I 荧光染料法. 如果本实验的检测灵敏度不高,就很可能将阳性结果判为阴性. 本实验以模拟的转基因大豆和转基因玉米1%、0.2%、0.04%的模板进行扩增. 结果如图3、图4,所有不同含量的标准品均能够正常扩增,由此可以确定此荧光定量PCR 方法的检测灵敏度为0.04%,完全满足国际上对转基因含量检测的最低标识(欧盟2003)0.9%的要求.精密度表征测定过程中随机误差的大小,表示测量的再现性,是保证准确度的先决条件. 一般说来,精密度不高,就不可能有高的准确度;反之,精密度好,准确度不一定高. 这种情况表明测定中随机误差小,但系统误差较大. 本实验选择不同水平0.04%、1.00%和5%转基因大豆和玉米TC1507样品,进行10次重复测定,通过统计分析方法计算该检测方法检测的精密度. 从表2可知,0.04%、1.00%和5%的转基因大豆和玉米TC1507样品的最终实际测定值分别为0.040 3%、1.085 5%、5.079 7%和0.040 6%、1.051 4%、5.034 4%;变异系数分别在1.948 4%~3.711 8%,说明本实验建立的方法准确可靠,具有良好的重现性.3 讨 论3.1 实时荧光PCR 技术进行定量的方式随着转基因标签制度的实施,对转基因产品检测的要求不仅是要能够给出是或否的定性检测结果,更要能够对农作物及其产品中的转基因成分进行精确定量,因此实时荧光定量PCR 检测技术正日渐成为转基因产品检测的热点问题. 利用实时荧光PCR 技术进行定量的方式有3种:第1种方式是目前国际上采用的质量百分比(m /m )对转基因产品进行定量,标准品是将不同质量百分比的转基因与非转基因干粉混合后提取DNA 定量检测;第2种方式是转基因产品(纯品)DNA 与非转基因产品DNA 的百分比,即将转基因产品纯品提取DNA 后,与非转基因产品的DNA 进行不同梯度的稀释,用所得的C t 值绘制出标准曲线:第3种方式是计算样品中的基因初始拷贝数,这需要将阳性质粒DNA 溶液作不同拷贝数的稀释,绘制出不同拷贝数的标准曲线[9]. 本实验采用的是第一种方式,探讨进行定量的可行性,通过标准曲线可以得出待检样品中外源基因DNA 的含量.3.2 荧光染料的优缺点由于FQ-PCR 是指在PCR 反应体系中加入能够特异标记PCR 产物的荧光物质,利用荧光信号积累实时监控整个PCR 进程,得到S 型的扩增曲线. 这种荧光物质可分为特异性荧光探针和嵌入荧光探针两大类. 本研究选用了嵌入荧光染料即SYBR Green I ,它是一种成本较低的结合染料的PCR 检测方法. 在反应体系中,加入过量SYBR 荧光染料,SYBR荧光染图5 使用SYBR Green I 染料测得标准品与待测样品的溶解曲线Fig. 5 Melting curve resulting from FQ-PCR analysiswith SYBR Green I dyeA 为引物CP4-EPSPS 特异扩增的溶解曲线;B 为引物PAT 特异扩增的溶解曲线A: Melting curve of the CP4-EPSPS gene; B: Melting curve of the PAT gene表2 转基因大豆Roundup Ready 和转基因玉米TC1507定量检测精密度结果分析Table 2 Precision analysis of quantitative detections of transgenic RR soybean and maize TC1507精密度分析Precision analysis转基因成分检测值 Quantity (% of content)转基因大豆Roundup ReadyGM soybean转基因玉米TC1507GM maize TC15070.04%1%5%0.04%1%5%平均值(10次重复)Average value (AV)标准偏差 Standard deviation (SD)变异系数 Coef fi cient of variation (CV/%)0.04030.00193.71181.08550.04753.06085.03970.05082.93890.04060.00173.20171.05140.06942.60115.03440.09811.948487015 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步. 其优点是对模板没有选择性,使用非常方便,但也易与非特异性双链DNA 结合并产生荧光信号,从而产生假阳性,引物二聚体是最常见的假信号源,而且任何非特异的双链DNA 的存在都会产生信号,这些荧光信号有可能被当作来自目标扩增序列的信号,特别是当目的序列的扩增量很少或者根本没有的时候,但是这些不足之处可以通过融解曲线的分析[10],优化反应条件,降低或者消除引物二聚体的干扰. 因为引物二聚体的片段一般很小,融解温度通常都比目标PCR 产物的融解温度低. 如果在高于引物二聚体的T m 但低于特异产物的T m 的温度下读板,由于引物二聚体已经变性,与之结合的SYBR Green I (SGI )都脱离下来,因此这个时候检测到的荧光都来自目标扩增序列,这就消除了因引物二聚体而产生的荧光信号. 而在这个温度下,大部分的特异产物仍然保持双链形式与SGI 结合. 此时检测到的荧光信号,就没有了因引物二聚体而产生的干扰信号,荧光信号就与特异扩增产物量的关联性更加紧密.3.3 定量检测存在的问题在荧光定量PCR 技术中仍存在一些有待解决的问题. 在标准曲线定量中,标准品的制备是一个必不可少的过程. 目前由于无统一标准,各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同,致使实验结果缺乏可比性. 另外,与传统的PCR 技术相比,FQ-PCR 的不足之处[11]是:(1) 由于运用了封闭的检测,减少了扩增后电泳的检测步骤,因此也就不能监测扩增产物的大小;(2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性,从而相对地限制了FQ-PCR 的复合式(Multiplex )检测的应用能力;(3) 目前FQ-PCR 实验成本比较高,从而限制了其广泛的应用. 随着技术不断改进和发展,目前FQ-PCR 已成为转基因检测技术的主要工具,该技术未来的应用前景是令人鼓舞的,一方面FQ-PCR 技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA 拷贝数成为可能. 另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及Real Time 技术的应用,使定量PCR 技术有一个足够的基础为广大检测室所接受,将有助于对转基因生物产品成分进行准确、快速的检测.References1 Zhang LG (张立国), Zhang J (张琚). 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主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究的开题报告
主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究的开题报告一、背景与意义随着生物技术的不断发展,转基因技术已经在农业生产中广泛应用。
而随之而来的问题是,转基因食品对人体健康及环境造成的影响是什么,消费者对转基因食品的安全性和可信度持怀疑态度。
因此,建立快速、准确、灵敏、稳定的转基因检测方法是保障食品安全、维护消费者权益的必要手段。
PCR技术作为一种传统和广泛应用的转基因检测方法,在转基因检测领域中占据重要地位。
本文旨在探讨主要转基因植物及其产品的PCR检测方法研究。
二、国内外研究现状目前,转基因检测方法主要分为两类:基于DNA检测的方法和基于蛋白质检测的方法。
其中,基于DNA检测的方法又可分为PCR、电泳、荧光定量PCR、实时荧光PCR、引物免疫层析、微纳装置等多种方法。
目前国内外主要的转基因检测技术为PCR方法,包括对加入商业化大量出产的转基因植株和转基因细胞系进行PCR检测,对转基因种子、转基因食品和转基因兽药进行PCR检测。
PCR方法不仅具有检测速度快、检测结果准确、检验灵敏度高等优点,而且操作简便、成本低廉。
三、研究内容和方法本文将就主要转基因植物及其产品的PCR检测方法进行研究,以具体的研究方法为目标,包括以下几方面内容:1. 转基因检测样品的采集和处理方法;2. PCR反应原理及扩增条件的优化;3. 转基因检测引物的设计与优化;4. PCR产物的检测方法及数据分析;5. 转基因检测方法的验证与评价。
四、预期成果本研究将建立一套可行的转基因检测方法,对主要转基因植物及其产品进行准确、快速、高效的检测;优化PCR反应条件,提高PCR扩增的灵敏度和特异性;开发适合转基因检测的引物,提高测试效率和精度;验证和评价PCR检测方法的可靠性和稳定性,为转基因检测技术的标准化提供参考。
以PCR鉴定转基因植株的微量DNA提取方法
第25卷 第1期西北农业大学学报V ol.25N o.1 1997年2月A cta U niv.A gr ic.Bo reali-occidentalis F eb.1997以PCR鉴定转基因植株的微量DN A提取方法巩振辉1 Cecchini E2 M ilner J J2(1西北农业大学园艺系,陕西杨陵712100)(2Ins titute of Biom edical&L ife S cience,Glas gow Un ivers ity,Glasgow,G128QQ UK) 摘 要 报道了将Dr M arc Zabeau的A FL P(A mplified F rag ment L eng th Po ly mor-phism)技术中的DN A提取方法用于以PCR(Po ly merase Chain Reaction)技术鉴定转基因植物——拟南芥、烟草和芜菁中。
该方法需约1h可完成植物D NA的提取,样品用量仅为30~100mg,产量可达30~80 g/g.粗提DN A(溶于10 L T E缓冲液)不必经过纯化,用T E缓冲液稀释5~10倍即可直接用于PCR分析。
在拟南芥、烟草和芜菁转基因植物鉴定中应用表明这一方法是目前以P CR法鉴定转基因植株T1代单株幼苗的一种简便、快速、有效的方法。
关键词 DN A提取方法,PCR分析,转基因植株鉴定,拟南芥,烟草、芜菁中图分类号 S603.5在植物基因转移与表达研究中,需要对经转化处理的幼苗进行分子检测,以尽早淘汰未含目标基因的非转化植株。
此外,一种新的基因转移方法——真空渗入法亦要求对大量的T1代单株幼苗进行分子检测[1]。
选择标记基因(如新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因和潮霉素磷酸转移酶基因等)和报告基因(如 -葡萄糖苷酸酶基因和荧光素酶基因等)已广泛应用于转化植株和组织的筛选,但在一些情况下,这种筛选效果不可靠[2~4]。
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8# 结果与讨论
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