7复习

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Uracil containing DNA (wild type) gets degraded
1.2. DpnI method--background
Recognition site for DpnI
DNA that is synthesized in vitro is not methylated and therefore not cut by DpnI
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第二遗传密码的特点
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简并性
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氨基酸序列不同的肽链可以有 极为相似甚至相同的 氨基酸序列不同的肽链 极为相似甚至相同 三维结构。 相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的 相同的氨基酸序列 三维结构。 在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而 在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近 相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形 成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成 成的肽段可以影响已经形成的肽段 对分子整体的影响等。
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常见“折叠病”
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英文
老年性痴呆症 痴呆 (Alzheimer syndrome) 帕金森氏症（ Parkinson disease） 帕金森氏 某些肿瘤（Cancer）
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Methods
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Unspecific (非特异性)
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Specific （特异性）
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Old unspecific
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Old specific
1.蛋白质和新生肽链折叠
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新生肽链的折叠
不仅指肽链在空间的盘旋卷曲，而是包括广义的新 空间的盘旋卷曲 生肽链的整个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、 亚基组装、水解激活等。
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蛋白质的折叠(protein folding) 从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链 的一维线性氨基酸序列转化为 具有特征三维结 一维线性氨基酸序列 构的活性蛋白质的过程。 构的活性蛋白质
U
Template U
Mutagenic primer
U
Transfect, grow in wild type E. coli (dut + ung+)
U Mutant Non-uracil containing DNA (wild type) is replicated
U
﹢
U
Template U
1. Mutant strand synthesis
A. denature DNA template B. Anneal mutagenic primers containing desired mutation C. Extend and incoporate primers with Pfu high-fidelity DNA polymerase
①最大的缺点是分辨率较低 ②对小分子蛋白效果不佳
结束语
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X射线晶体学、NMR、电镜三维重构各有优 缺点
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将这几种方法结合共同研究结构和功能可 以使我们对所研究的分子有更为全面的理 解，而这些信息是单个方法无法提供的。
1.HPP里程碑
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两谱：蛋白表达谱、修饰谱 两图：蛋白连锁图、亚细胞 定位图 连锁图 三库：样本库、抗体库、数据库
2、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子
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分子伴侣 （molecular chaperone） 折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。 折叠酶：
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蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI) 肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI)
1.1 The Kunkel method
DNA template preparation in E. coli dut - ungU U U U
Template U
in vitro generated strand contains no U !!! U extend primer with DNA pol in vitro U U U
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UV X-ray Other chemical
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Cassette mutugenesis （盒式突变）
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New specific
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New unspecific
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Transposons（转座子） degenerated primers（简 并引物）
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Oligo-directed site mutagenesis（寡核苷酸 介导定点突变） PCR based site mutagenesis（PCR介导 定点突变）
2. DpnⅠDigestion of Template
Digest parental methylated and hemimethylated DNA with DpnⅠ
3. Transformation
transform mutated molecule into competent cells for nick repair
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蛋白质三维结构测定方法及数量
6. X射线晶体结构测定优缺点
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优点
①分辨率高 ②不损伤样品 ③无污染 ④相对快捷 ⑤能得到晶体完整性
的大量信息
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缺点
①晶体构象是静态的， 不能测定不稳定的过 渡态的构象； ②很多蛋白质很难结 晶，或者很难得到用 于结构分析的足够大 的单晶；（瓶颈） 的单晶 ③X射线晶体衍射的工作 流程较长。
4. Selection and verify
3.1 Applications of gene fusion
2. 蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
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总原则
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以合理的效率、速度、收率和纯度，将 目标蛋白从 以合理的效率、速度、收率和纯度 目标蛋白 细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离 出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。 同时仍保留其生物学活性和化学完整性
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因此，当熵增加时，系统的自由能便会下降
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物理和化学过程达到平衡时，
即达到系统的自由能最小而熵最大
6.与折叠有关的疾病(“构象病”)
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“分子病”:由于基因突变造成蛋白质分子中 仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的 仅仅一个氨基酸残基的变化 情况，如地中海镰刀状红血球贫血症 “折叠病”:蛋白质分子的氨基酸序列没有改 变，只是其结构或者说构象有所改变引起 只是其结构或者说构象有所改变 的疾病。
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molecular chaperone
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A large and diverse group of unrelated proteins that all share the functional property of assisting the noncovalent assembly and/or disassembly of protein containing structures in vivo, but are not permanent components of these structures when they are performing their normal biological functions. 一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同 相互之间没有关系 功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行 非共价的 帮助其他含蛋白质的结构 组装和卸装， 组装和卸装 但不是这些结构在发挥其正常的生物学 功能时的永久组成部分。
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硫酸铵分级沉淀、 有机溶剂分级沉淀、 超速离心、 硫酸铵 有机溶剂 超速离心 等电点沉淀、 等电点沉淀 透析、超过滤、蛋白质结晶等。 透析、超过滤、蛋白质结晶
6. 蛋白质的细分级
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粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分 离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分 离纯化 子大小、分子形状、分子表面特征或分 子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质 细分级。 常用的实验技术：层析和电泳
3、核磁共振技术优缺点
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优点 ①同样具有高分辨 率 ②在溶液中操作， 接近生理状态
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缺点
①分子量要比较小（50KD以 下） ②对不溶的蛋白比较困难 （如膜蛋白） ③实验周期长（>1年）
3. 电子显微技术的优缺点
优点 1.可以直接获得分子的形貌信息； 2.适于解析难以结晶的膜蛋白，大分子复合体 等； 缺点
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多意性
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全局性
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5.热力学第二定律 之熵判据
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热力学将不能做功的随机和无 序状态的能定义为熵，以S表 示
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宇宙或系统的各种过程总向着 熵增大的方向进行
热力学第二定律 之自由能判据
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热力学将系统中总的热量称为焓，以H表示 在恒定温度和压力条件下总能量中可以做功的 恒定温度和压力条件下 那一部分能量为自由能，以G表示 DG = DH-TDS (T为绝对温度)
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3.分子伴侣与酶的异同点
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分子伴侣的定义完全是功能上的。 分子伴侣与酶的异同点
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相同点
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参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现 分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性 分子伴侣的催化效率很低 分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进 其正确折叠。
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不同点
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பைடு நூலகம்
4.第二遗传密码
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现有的遗传密码仅有从核酸序列到无结构的多肽链的 信息传递， 信息传递 因此是不完整的。 无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递 部分—遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列 与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折 叠密码
一、蛋白质工程的概念
以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关 的 系作为基础，通过化学、物理和分子生物学 化学、物理和分子生物学的 基因修饰或基因合成 ，对 现有 蛋白质 手段进行 手段进行基因修饰或基因合成 基因修饰或基因合成，对 ，对现有 现有蛋白质 改造 ，或 制造 一种 新的蛋白质，以满足人 进行 进行改造 改造，或 ，或制造 制造一种 一种新 类对生产和生活的需求。 生产和生活 工程化：理念－设计－制造－功能实现
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步骤
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选择实验材料，实验材料预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定
5. 蛋白质的粗分级
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使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提 蛋白质提取缓冲液 取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简 单的方法使目标蛋白质浓缩，同时 去除大量的杂 使目标蛋白质浓缩 质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。