第7章 蛋白质的分离、纯化和表征

渗透压法测定相对分子质量
在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的
关系为： π= RT(c/Mr
+ K c2 )
Mr = RT/ limπ/c

c→0
7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数
扩散（diffusion） dm/dt =-DA dc/dx
D 扩散系数， A 扩散面积
分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利
用蛋白质之间各种特性的差异，包括：
分子的大小和形状 酸碱性质
溶解度
吸附性质
对配体分子的特异生物学亲和力
Protein Purification and Characterization
The aim of protein purification is to isolate
铁的原子量 铁的百分含量=─────── ×100 最低相对分子质量 铁的原子量 最低相对分子质量=───────×100 铁的百分含量
Protein size and shape
55.8
例如，肌红蛋白相对分子质量=───×100 0.335
=16700 用其他物理化学法法测得的 肌红蛋白Mr与此极为接近，可 见肌红蛋白分子中只含一个 铁原子。
7.3 蛋白质的胶体性质
与蛋白质的沉淀
Protein’s colloid character and deposition
7.3.1 蛋白质的胶体性质
蛋白质溶液是一个分散系统 分散相质点 <1nm的为真溶液，
> 100nm的为悬浊液， 介于1-100nm的为胶体溶液。
Protein colloid character and deposition
可以发生明显的变化。 蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。
没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解
离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数 相等时的pH称为等离子点(isoionic point)。
Ionization of protein
+
Overall charge on protein acid excess positive charge Cation exchanger isoelectric point balanced positive and negative charge
dm’=- DA dc/dx dt
沉降分析法测定相对分子质量
当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液
面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度， 因此：

2RTdln(c2 / c1) Mr = ───────── (1-υρ) ω2(x22-x12)
7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量
胶体系统的稳定条件：
1 分散相质点的大小 2 分散相质点带有同种电荷 3 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层
+ + +
Protein colloid character and deposition
每克蛋白质分子能结合0.3-0.5克水。 蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及
凝 胶 过 滤 法 测 定 相 对 分 子 质 量
lg
层析柱的洗脱体积与分子量的关系： Ve=K1-K2lgM
7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定
相对分子质量
SDS， 有效变性剂，带负电荷 巯基乙醇，打开二硫键 蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。
Rf =
K1-K2 lg M
Marker
Electrophoresis of Protein
In polyacrylamide(聚丙烯酰胺) gel
electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous(可渗透的，多孔的) polyacrylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size. Small/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteins
In contrast, the larger molecules have only the liquid surrounding the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱) first. The smaller molecules move more slowly through the column and elute later.
deposition Principles of Protein purification Protein content and purity determination
Protein Purification and Characterization
因材施法，有的放矢
Protein Purification and Characterization
Small molecules can enter the pores in the beads whereas larger or more elongated molecules cannot. The smaller molecules therefore have a larger volume of liquid accessible （可达到的，可接近 的） to them; both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads.
alkaline excess negative charge Anion exchanger
3
10
pH
The overall charge on a protein depends on pH _
7.2 蛋白质分子的大小与形状
Protein size and shape
7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量
one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of the protein of interest
不能通过半透膜的性质。
Protein colloid character and deposition
The hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of protein
７.1 蛋白质的酸碱性质
Ionization of protein
对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正
电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这
一pH称为蛋白质的等电点 (isoelectric
point, pI)。
Ionization of protein
蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下
沉降速率法 沉降平衡法
沉降分析法测定相对分子质量
离心机 转速 60 000-80 000rpm（rotation per
minute ） 离心力 400 00- 700 000g
沉降分析法测定相对分子质量
离心力 4π2 v 2 r F = ----------g :离心力，单位以地心引力的倍数g表示（即g 或×g） :重力加速度，等于980.6 cm2/s2. : 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间 的距离（cm） :为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数 （rpm）表示，则上式应为 4π2 v 2 r F = ----------- （1/60）2 g
7.2.4.2 沉降平衡法
利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度
（8000 -20000r/min）的离心场中进行的。
蛋白质的沉降平衡（图7-3）
沉降 分析 法测 定相 对分 子质 量
在时间dt内浓度为c的溶液越过横截面A的溶质量：
dm=-cA
dx/dt dt
因此扩散作用沿相反方向越过横截面A的溶质量：
对蛋白质分子进行的各种研究， 要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生 物与化学分子的独特的性质） 和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。
蛋白 质
大分 半透 子
透析 袋内
小分 子
膜
透析 袋外
小分 子
Protein Purification and Characterization
Gel filtration chromatography
凝胶过滤法的原理
Gel filtration chromatography
Size exclusion chromatography Molecular sieve（筛子） chromatography
Molecules are separated on the basis of their size and shape. The protein sample in a small volumes is applied to the top of a column of porous(有孔的) beads that are made of an insoluble but highly hydrated （亲水的） polymer such as polyacrylamide (Bio-Gel) or the carbohydrates dextran （葡聚糖 ） (Sephadex) or agarose (琼脂糖) (Sepharose)