一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立
一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法[发明专利]
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专利名称：一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法
专利类型：发明专利
发明人：虞留明,张有淘,陈薇
申请号：CN201610393879.X
申请日：20160606
公开号：CN106086161A
公开日：
20161109
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂及其制备与使用方法，该检测试剂由以下成分及其含量组成：20‑200mmol/L HEPES缓冲液、20‑100mmol/L柠檬酸盐缓冲液、50mmol/L 1‑豆蔻酰基‑2‑(4‑对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱液、20‑100U/L脂蛋白磷脂酶A2校准品以及
20‑100U/L脂蛋白磷脂酶A2质控品。
该检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对脂蛋白磷脂酶A2的测定，可以高通量、快速化、精确地确定生物样品中的脂蛋白磷脂酶A2含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点。
申请人：苏州博源医疗科技有限公司
地址：215163 江苏省苏州市高新区锦峰路8号9号楼北二层
国籍：CN
代理机构：广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙)
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一种磷脂酶A2抑制剂体外筛选方法的建立
一种磷脂酶A2抑制剂体外筛选方法的建立刘彬;齐云;王敏;蔡润兰;宋杨【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2006(22)7【摘要】目的建立磷脂酶A2(PLA2)抑制剂体外筛选的方法.方法以大豆磷脂酰胆碱为底物,通过分光光度法测定PLA2水解底物产生游离脂肪酸的量,间接反映待测物对PLA2活性的影响,并考查酶浓度、底物浓度及反应时间与游离脂肪酸生成量的线性关系.结果在一定范围内,酶浓度、底物浓度及反应时间与游离脂肪酸生成量呈良好的线性关系,氯丙嗪对PLA2的IC50为501 μmol·L-1,甘草甜素对PLA2的IC50为461 μmol·L-1.结论建立的磷脂酶A2抑制剂体外筛选方法,具有灵敏度高、快捷、准确、可操作性强的特点.【总页数】3页(P890-892)【作者】刘彬;齐云;王敏;蔡润兰;宋杨【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】R345.61;R965.1;R977.3【相关文献】1.HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立 [J], 王云华;王睿睿;杨柳萌;李健峰;徐维明;郑永唐2.HIV-1核衣壳蛋白NCp7抑制剂体外筛选方法的建立 [J], 王云华;王睿睿;杨柳萌;李健峰;徐维明;郑永唐3.基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法[J], 罗森;丁朋晓;李涛;王琴;王慧4.建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法 [J], 李惠;叶庆;李运曼5.HIV-1衣壳蛋白抑制剂体外筛选方法研究进展 [J], 张大为;许晓双;常珊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
M型磷脂酶A2受体抗体高灵敏定量方法的建立及临床应用
M型磷脂酶A2受体抗体高灵敏定量方法的建立及临床应用黄飚;王凉;肖华龙;张艺;张秋花;杨雪;胡志刚【摘要】目的建立抗PLA2R抗体的超灵敏定量检测方法,改进抗PLA2R抗体检测在膜性肾病诊治中的应用.方法筛选出一个含高浓度抗PLA2R抗体的血清,采用尿素解离结合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗体,并进行IgG抗体定量,推算出原血清中抗PLA2R抗体的浓度,将此已知抗PLA2R抗体浓度的样品稀释到不同浓度作为抗PLA2R抗体的标准品.建立抗PLA2R抗体TRFIA检测方法,从批内批间精密度、灵敏度、回收率、测量范围、临床应用等方面对建立的TRFIA方法进行评价.结果制备了抗PLA2R抗体标准品,设置的抗PLA2R抗体的标准品浓度分别为0 μg/ml、0.17μg/ml、0.68 μg/ml、3.42 μg/ml、17.1μg/ml、68.4 μg/ml、343μg/ml.有效检测范围为0.02μg/mL-343 μg/ml,3份标本的回收率均值为98.96％,低、中、高浓度批内CV％(n=20)分别为6.38％、5.55％、4.88％,低、中、高浓度批间(n=8)CV％分别为7.69％、6.23％、6％,均＜10％.正常参考范围为0-0.89μg/ml,29％的IgA肾病、44.4％的红斑狼疮肾病、88.5％的IMN抗PLA2R抗体阳性.红斑狼疮肾病患者、IgA肾病患者和IMN患者的血清PLA2R抗体含量均显著高于健康体检者,对应的P值分别为0.036、0.034和0.000,P均＜0.05.以正常健康人作为对照组,血清抗PLA2R-IgG抗体在红斑狼疮肾病、IgA肾病和IMN的灵敏度和特异度曲线下面积AU-CROC分别为:0.738、0.607、0.968,其中对应肾病的检测准确性程度由高到低分别为:IMN、红斑狼疮、IgA肾病.结论为膜性肾病患者提供一个除穿刺以外的可临床实际应用的血清学诊断指标,为该病的诊断、活动性的判断、治疗时机的把握、药物的选择及疗效判断提供了一个理想的血清学标志物.%Objective To establish an ultrasensitive detection method of PLA2R antibodies.Improve the application of PLA2R antibodies in membranousnephropathy.Methods Select a serum with high-concentration PLA2R antibodies.Dissociated PLA2R antibodies based on urea fromPLA2R.Calculated the original anti PLA2R antibodies concentration in serum with IgG antibody quantitative.The concentration of a known PLA2R antibodies of the sample diluted to different concentrations as a standard of anti PLA2R antibodies.To establish a detection method of PLA2R antibodies by TRFIA.To evaluate TRFIA method from the intra-and inter-batch precision,sensitivity,recovery rate,measurement range and clinical application.Results Recombinant PLA2R of the specific immune reactivity was generated and it can be used to detect PLA2R antibodies.The standard of PLA2R antibodies were prepared.Quantitative detection of PLA2R antibodies was performed on the basis of the PLA2R antibodies standards.We developed a highly sensitive and quantitative assay forPLA2R using a time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) for the detection of PLA2R antibodies.This method detects PLA2R antibodies to a lower limit of 0.02 μg/L,with a broad measurement range of 0.02-343 μg/L.The average recovery rate was 98.96％.The intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CVs) were both ＜ 10％.According to our results,when the cut-off for normal anti-PLA2R-IgG concentration was defined as ＜0.89 μg/mL,the positive rate of detection was 88.5％ in IMN,29 ％ in IgA nephropathy cases,44.4％ in lupus nephropathy cases.Lupus erythematosus (sle) patients with kidney diseasepatients,patients with IgA nephropathy and IMN of PLA2R serum antibody levels were significantly higher than that of healthy physicalexamination,the corresponding P values were 0.036,0.034 and 0.000.In normal healthy people as control group,serum anti PLA2R-IgG antibody in lupus erythematosus (sle) and kidney disease,IgA nephropathy,IMN sensitivity and specific AUCROC offline area are:0.738、0.607、0.968.The corresponding kidney disease detection accuracy degree from high to low are:IMN,lupus erythematosus,IgA nephropathy.Conclusion This research provides an ideal serological marker for the diagnosis of the disease,active judgment,treatment timing,selection of drugs and curative effect judgment.This method will make the diagnosis of the disease and monitoring is more convenient,and it is easy to be accepted by patients,it is helpful to early diagnosis and treatment of idiopathic membranous nephropathy.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2017(021)011【总页数】6页(P1927-1932)【关键词】时间分辨荧光免疫分析;膜性肾病;特发性膜性肾病;磷脂酶A2受体【作者】黄飚;王凉;肖华龙;张艺;张秋花;杨雪;胡志刚【作者单位】江苏省原子医学研究所,江苏无锡214063;南京医科大学附属无锡人民医院,江苏无锡214023;南京医科大学附属无锡人民医院,江苏无锡214023;江苏省原子医学研究所,江苏无锡214063;南京医科大学附属无锡人民医院,江苏无锡214023;南京医科大学附属无锡人民医院,江苏无锡214023;南京医科大学附属无锡人民医院,江苏无锡214023【正文语种】中文【中图分类】R692膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是引起成人肾病综合征的一个最常见的病因之一，约占30-40%，也是原发性肾小球疾病中最为常见的疾病[1,2]。
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一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立朱京童郑智慧路新华范玉玲张华贺建功（华北制药集团新药研究开发中心，微生物药物国家工程研究中心石家庄050015）摘要：目的：磷脂酶A2(PLA2)是一个重要的抗炎和心血管疾病药物靶点，本研究拟建立一种荧光的磷脂酶A2(PLA2)抑制剂体外高通量药物筛选方法。
方法：以7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为荧光底物，水解产物在355ex/460em下有特定荧光，间接反映酶活性。
利用96孔板，通过对酶浓度、反应时间等多个条件的优化，摸索最佳的反应条件。
利用阳性药二乙烯三胺五乙酸进行模型验证。
结果：在酶浓度2.25U/ml、底物浓度30μM和反应时间30min时，为最适反应条件。
阳性药在该模型上表现出好的浓度剂量依赖抑制效果，IC50为0.37µmol/L。
利用该模型，本研究从微生物次生代谢产物筛选得到两个活性化合物F02ZA-2396A、F02ZA-2396B，其IC50分别为152μM和72μM。
结论：本研究建立了一个高通量的磷脂酶A2抑制剂体外药物筛选方法，该方法灵敏、快捷、可操作强，可用于各种来源的化合物的快速活性筛选。
关键词：磷脂酶A2；抑制剂；体外；荧光法A fluorescence-based method on the high throughput screening assayfor PLA2 inhibitor in vitroZhu Jing-tong, Zheng Zhi-hui, Lu Xin-hua, Fan Yu-ling, Zhang Hua, He Jian-gong(New Drugs Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering & Research Center, Shijiazhuang 050015) ABSTRACT: OBJECTIVE: To establish a fluorescence-based method in vitro for high throughput screening phosphplipase A2(PLA2) inhibitor. METHODS: using 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate as a fluorescent substrate，to determine the activity of phosphplipase A2 by measuring the 355ex/460em fluorescence value in 96-well microplates, The effect of positive drugs and samples on phosphplipase A2activity were evaluated. RESULTS: With 2.25U/ml concentration of the enzyme, 30μM concentration of the substrate and 30 min reaction time, there is a dose-dependent manner between them.. Positive control, DTPA showed good inhibitory activity in dose-dependent manner with IC50of 0.37µmol/L , In the course ofscreening for PLA2inhibitors from metabolites of microorganisms, two compounds named F02ZA-2396A and F02ZA-2396B were conformed as the PLA2 inhibitors, their IC50value are 152μmol/l and 72μmol/l，respectively. CONCLUSION:The method is sensive, rapid, accurate valid for screening the PLA2 inhibitors in vitro.KEY WORDS: phosphplipase A2 ;inhibitor; in vitro; fluorescence作者简介：朱京童，（1977年出生），女，硕士在读，工程师。
研究方向：药物筛选基金资助：国家科技部创新药物筛选技术平台研究资助项目，项目编号：2002AA2AZ343D通信地址：E-mail:zhujingtong2003@磷脂酶A2(phospholipase A2 PLA2)是一种重要的代谢和调节酶类，已有150个以上的氨基酸序列可在蛋白质序列库中找到[1]。
在生物界中分布广泛，大量存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒，动物胰脏及植物组织中[2]。
所有的PLA2都有一种最基本的作用，就是水解磷脂sn-2位脂肪酸，释放自由脂肪酸和溶血磷脂，直接或间接作用于靶细胞，广泛参与人体生理性细胞内外信号的传递及炎症、多种炎症相关疾病等多种病理过程。
是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介质生成的限速酶，促进了一系列炎性介质和细胞因子的大量释放和激活，是前列腺素和血小板活化因子生成的关键酶，在炎性病变的发生和发展过程中起重要的作用，直接影响其发展和预后[3]。
因此磷脂酶A2抑制剂近年来越来越引起了人们的极大关注。
为了寻找新的PLA2抑制剂，本研究利用荧光方法建立了一种高通量的PLA2抑制剂体外筛选模型，该模型的建立为从微生物的次生代谢库、合成化合物库以及植物来源的化合物中发现新的PLA2抑制剂，研究开发新的PLA2抑制剂药物研发奠定基础。
1 材料与方法1.1 筛选用微生物菌株放线菌和真菌由本室微生物菌种库提供，微生物的代谢产物经溶媒提取，DMSO溶解作为筛选样品。
1.2 试剂及仪器磷脂酶A2（PLA2）购自Sigma公司,荧光多肽底物7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate购自BIO-MOL公司；二乙烯三胺五乙酸（Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA）购自Sigma公司；Victor1420２多标计数仪（美国PE公司）1.3 PLA2活性测定原理及方法测活原理与方法参考文献[4,5]，并稍加改动。
缓冲液配方：50mM Tris-HCL ,25mM CaCL2（PH 8.0）。
缓冲液预先保存于4°C。
以荧光标记的多肽7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为底物，利用水解后的产物在355ex/460em的荧光读值，通过测定酶反应前后荧光F值的变化，确定PLA2酶的活性。
反应式如下：PLA27-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 7-Hydroxycoumarinyl + arachidonate（355ex/460em）筛选的操作过程为[6]：在96孔板中加入测试样品（DMSO溶解）2µl/孔，用等体积DMSO作为对照，加PLA2酶液35µl/孔。
使用1420 Victor2多标计数仪在355/460nm波长下，读取每孔F1值（样品本底F1）；加入底物15µl，37℃保温反应30分钟后再次读取每孔的F2值，并计算抑制率，[F2 - F1 ](对照)－[ F2 - F1 ](样品)样品抑制率(I%) ＝×100%[F2 - F1 ](对照)－[ F2 - F1 ](空白)1.4 真菌F02ZA2396A、F02ZA2396B的培养将菌株斜面接种于种子培养基（淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%, 酵母0.5%, CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2ONaCl 0.2%，pH 7.0），27℃摇瓶培养3天。
按1%接种的量接种发酵培养基(淀粉1.0%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1.3%，酵母粉0.4%，麦芽粉0.8%，NaCl 0.05%, CaCO3 0.15%, pH 7.0) 27℃振摇培养6天。
1.5模型的验证：Z’因子是评估测试方法质量的主要参数[7]。
Z’=1-3x(SDs+SDb)/[MS-MB]，(SD=标准差, s=信号, b=背景)。
范围可以从1到小于0。
在测试方法的建立确证和高通量筛选的过程中，Z’因子应大于0.4。
2.实验结果2.1 不同酶浓度与水解产物生成量（ΔF值）的关系为了确定最佳的酶反应浓度，固定底物浓度30μM和反应时间30min，将酶液进行稀释。
酶起始终浓度72 U/ml，后二倍梯度稀释12个浓度组（至0.03 U/ml）进行活性测定。
结果（图1）显示，酶浓度在0.28—2.25U/ml间与ΔF值呈良好线性关系。
当酶浓度大于2.25U/ml，ΔF值转向平衡。
该模型的酶量从线性范围较好的酶浓度确定，本研究选择酶浓度为2.25 U/ml。
图1 不同酶浓度与ΔF值变化的关系2.2 反应时间与水解产物生成量（ΔF值）的关系为了确定最佳的反应时间，利用96孔板，在底物终浓度为30μM、酶浓度2.25 U/ml的条件下，测定不同反应时间（0min－180min，每隔5min测定一次）与ΔF值的关系。
图2显示在反应时间为35分钟范围内与ΔF值之间均呈很好的线性关系。
反应35分钟后，ΔF 值渐趋向平衡。
根据结果，选择线性范围内反应时间（0 35min），所以将模型筛选时反应时间控制为30分钟左右。
图2 不同反应时间与ΔF值变化的关系2.3阳性对照二乙烯三胺五乙酸对PLA2的抑制活性为了验证所建立模型的灵敏度和稳定性，本研究利用已报道的PLA2的抑制剂二乙烯三胺五乙酸（图3）作为阳性药物。
固定底物浓度30μM、酶浓度2.25U/ml 和反应时间30min，二乙烯三胺五乙酸起始终浓度为100µmol/L ，后二倍梯度稀释18个浓度组进行抑制活性测定。
结果（图4）表明二乙烯三胺五乙酸在该模型上表现出强的抑制活性，在0.006－25µmol/L间并具有较好的量效关系，其IC50为0.37µmol/L。
筛选模型的Z’因子>0.87 ,信噪比（S/B）>5。
图3二乙烯三胺五乙酸的化学结构图4 二乙烯三胺五乙酸对PLA2的抑制曲线2.4 F02ZA2396A 、F02ZA2396B对PLA2活性抑制作用在酶浓度2.25U/ml，底物浓度30μM下，37°C反应25分钟，对F02ZA2396A（图5）、F02ZA2396B（图5）进行活性测定。