高通量筛选技术应用
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高通量筛选技术在医药领域的应用
药物高通量筛选技术分类(筛选平台):分子平台、细胞平台、酵母平台、动物平台
动物平台。前两种平台都是体外模型,有些药物在 体外模型中虽然能够显示良好活性,但是进入动物 体内检测的时候活性却大大降低,甚至没有活性。 主要原因是由于在动物体或人体中, 药物作用的发 挥不仅需要药理活性,还与它的分布、吸收、代谢、 排泄有关。有些体外活性良好的药物,由于脂水分 配系数问题, 导致机体不能吸收,或是不能正确分 布到作用靶位点,所以体内活性大幅度降低。动物 平台是近几年发展起来的新技术,在一些疾病的研 究上已经显现了重要作用,但仍旧需要不断完善。
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高通量筛选技术在医药领域的应用
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高通量筛选技术在酶工程领域的应用
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高通量筛选技术在基因领域的应用
高通量筛选技术在医药领域的应用
高通量筛选( high-throughout screening)是近年来迅速发展起来的药物筛选技术 ,它通过运用基 因科学 、蛋白质科学 、分子药理学 、细胞药理学 、微电子技术等多学科理论和技术 , 以及与疾 病相关的酶和受体为作用靶点 ,对天然或合成化合物进行活性测试 , 并在此基础上进行筛选 。 高通量筛选具有快速 、高效 、经济 、高特异性等优点 ,其中所用的样品量甚少的特点 尤其适用于天然化合物的活性筛选
高通量筛选技术在酶工程领域的应用
特点:理性设计和定向进化
现阶段人们还没有完全掌握对酶的空间构象预测 、结构分析 等技术 , 所以试图通过理性设计达到改善酶特性的目的仍然很 难实现 , 因此 , 通过非理性设计特别是定向进化技术来改造酶 特性的策略依然是人们关注的焦点。 酶的定向进化包括两个重要的步骤 , 首先是变异体库的建立 , 其次是对最适突变体的筛选与鉴定
高通量筛选技术在基因领域的Байду номын сангаас用
高通量筛选技术在基因领域的应用:
RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具, 利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的 目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉 寂通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA)进 行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物, 是RNAi发挥效应所必需的因子。
高通量筛选技术在基因领域的应用
文库筛选法:
包括4个步骤: 针对基因编码区靶点的DNA序列在芯片上合 成后,通过公用的接头, PCR克隆进入慢病毒载体,并包 裹病毒;将慢病毒文库侵染细胞,启动shRNA序列表达的 序列被整合到细胞基因组上,而沉默细胞内该基因的表达; 在特定时间、药物诱导下,存活下来的细胞得以扩增;提 取细胞的基因组,深度测序,找到相应shRNA拷贝数。
基于自组装细胞芯片的细胞迁移筛选流程图
高通量筛选技术的应用
高通量筛选技术未来的发展:
高通量筛选技术具有以下几方面的发展趋势:
①采用基于细胞的分析筛选方法,可直接在活细胞内检测化合物,提高筛选的准确性;
②采用精确的检测技术,使之能够在相同的分析过程中兼顾效率和特异性;
③基于功能基因组学的药物高通量筛选逐渐受到重视并应用; ④开始分析和处理工业中的实际问题。该系统在后基因组时代研究和药物发现之间架起桥梁,将 很快渗入到未来市场中,打破从基因到药物研发链条中的瓶颈
高通量筛选技术的应用
高通量筛选( HTS)又称大规模集群式筛选,是由高容量 化合物库、自动化操作、高灵敏度检测、高特异筛选模型、 高效率数据处理 5 个子系统有机组合而成,是一种新型、 高自动化、高灵敏度、高通量的筛选技术。
其理论基础是反向药理学( reversepharmacology),即基 于受体、酶及离子通道等分子、细胞水平药物作用靶点, 从 现有化合物库中筛选出具有生物活性的先导化合物,在此基 础上再进行组织、器官及疾病相关动物模型研究
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该方法不仅灵敏 , 而且经济实用 , 除了可以检测脂肪酶以及酯酶的酶活和对映选择性 外 , 还可以用来筛选其他催化水解反应的酶类 , 如蛋白水解酶 、脱酰胺酶等。
高通量筛选技术在酶工程领域的应用
酵母表面展示技术 ( Surface Display)是一类筛选蛋白质突 变体库的高通量筛选方法, 在抗体蛋白的研究中应用尤其广 泛, 具有高效、灵敏等特点。
高通量筛选技术在酶工程领域的应用
筛选方法分类:
高通量筛选技术在酶工程领域的应用
分光光度测量法和荧光检测法:
Rey mo nd 与其同事利用 伞形酮建立了一种巧妙的 高通量筛选方法优点在于 底物能在比较高的温度或 者比较宽的 pH 范围内保 持稳定 , 并且可以通过构 建不同的底物来检测不同 的酶 。
因此, 高通量 siRNA 筛选技术也成为生物学最强有 力的研究工具之一
高通量筛选技术在基因领域的应用
高通量筛选技术在基因领域的应用
逐一筛选法:
将文库siRNA逐一转染到孔板的每个孔, 72 h后, 基因被沉默降低到一定程度。加入包 被I-SceI的腺病毒, 侵染细胞过表达I-SceI。 48 h后, 细胞内sensor上靶点序列被I-SceI 切割, 诱导同源重组。 将细胞固定染色, 通过高通量筛选仪器获取信号, 进行分析统计。
基本原理:将外源目的蛋白基因整合到特定的载体后, 通过 电转或其他的转化方法将其导入酵母细胞, 用酵母细胞内蛋 白转运机制将目的蛋白移至细胞表面并且固定在细胞膜上。
酵母表面展示技术:作为真核表达系统, 它具有的翻译后加工 机制对真核蛋白来的表达来说其优越性是显而易见的 ; 其次, 该方法将酶固定在细胞的表面, 从某种意义上来说它起到了固 定化的效果, 而这种效果有可能显著的提高酶的活力或者对映 选择性; 最后, 它是一种真正意义上的高通量筛选方法, 通过荧 光激活细胞分选系统,每次可以对106 ~ 1010个突变体进行筛选
高通量筛选技术在基因领域的应用
高通量siRNA筛选的新发展方向:
自组装细胞芯片是在一张玻璃片上覆盖 PNI膜,通过 刻蚀产生规则的小孔矩阵。PNI 膜具有温度敏感性, 低温下遇水快速溶解, 细胞无法在其上生长。 每个 小孔的孔径可以根据需要进行适当调节, 保证其中 容纳的细胞数在 1 000 个左右,具有统计意义。通过 反向转染,可以在刻蚀产生的小孔内点上 RNAi 文库; 在整个芯片上铺细胞,形成细胞岛,每个小岛就是一 个独立的样本。一张 4 cm2 的芯片上,可以容纳 12×12 个点,筛选容量超过一个 96 孔板。自组装芯 片具有良好的平行性,孔与孔之间交叉污染极少,可 以有效地保证实验准
高通量筛选技术在酶工程领域的应用
酸检测法:是一种经常应用于脂肪酶或者酯酶的高通量筛选方法 , 主要包括 pH 指示
剂法 、乙酸法以及最近出现的荧光钠盐法 。 荧光钠盐( uoresceinsodium salt ) 是一种具有绿色荧光的有机盐 , 当用该盐作为酶促反应的 指示剂时 , 随着反应体系中酸的增加 , 该盐的荧光会逐渐被 H +离子所淬灭 , 因此 , 通过检测 其在 495 nm 处吸光值的变化我们便可以检测出酶促反应的速率
高通量筛选技术在医药领域的应用
由于天然药物中成分复杂性及多种成分间可能存在的协同作用 , 因此有效成分的分析 、鉴定 和筛选是天然药物开发中的一个难题。同时,许多天然药物临床资料相对不足, 仍需要进行必要 的再认识和验证 。面对海量的天然药物 , 高通量筛选技术特有微量 、快速 、灵敏和准确等特 点。