ELISA技术方法原理参考幻灯片

• 结合在固相载体上的酶量与标本中受检
物质的量成一定的比例。加入酶反应的
底物后，底物被酶催化变为有色产物，
产物的量与标本中受检物质的量直接相
关
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在ELISA方法中有三个必要的试剂：
• （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent）；
• （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” （conjugate）；
测
抗
孵育
洗涤
原
底物显色
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• 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部 位，其一端与包被于固相载体上的抗体 结合，另一端与酶标记的特异性抗体结 合。
• 此法适用于检验各种二价或二价以上的 大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、 hCG等。不能用于分子量小于5000的半 抗原或小分子单价抗原的测定。
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操作步骤如下：
（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗IgM， 洗涤。
（2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被 固相抗体捕获，洗涤。
（3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM 结合，洗涤。
（4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上 的抗原反应结合，洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在 特异性IgM抗体，是为阳性反应。
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双抗原夹心法测抗体
• 反应模式与双抗体夹心法类似。 • 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，
以检测相应的抗体。 • 此法中受检标本不需稀释，可直接用于
测定。 • 乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。
关键在于根据抗原结构的不同制备酶标 抗原。
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间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
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ELISA的应用
ELISA法在生物医学各领域的应用范围概 括为四个方面
• 免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 • 研究抗酶抗体的合成。 • 显现微量的免疫沉淀反应。 • 定量检测体液中抗原或抗体成份。
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ELISA基本 原理
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面， 并保持其免疫活性
• 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原 或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其 免疫活性，又保留酶的活性
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操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液， 使之与固相抗体反应，孵育洗涤。
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多， 故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量 越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表 受检标本抗原的量。
酶联免疫吸附法
（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
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ELISA 的发展
• 50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免 疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用 酶来标记抗原或抗体的分析技术
• 1971年此项技术由瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道，将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测 定方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）
• （3）酶反应的底物。
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用于临床检验的ELISA主要有以下 几种类型：
双抗体夹心法测抗原（常用）
• 夹心法
双抗原夹心法测抗体
• 间接法测抗体（常用） 竞争法测抗原
• 竞争法
竞争法测抗体
• 捕获包被法测抗体 • 亲和素-生物素 ELISA法
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双
包被特异性抗体
抗
洗涤
体
加入待测样品
夹
心
孵育
洗涤
法
加酶标特异性抗体
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◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体 结合。
◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与 固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体 结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。
◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与固相抗体 的结合最充分。
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竞争法测抗体
• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得 到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗 体。
优点 特异性高
受检标本不需稀释， 可直接用于测定，因 此其敏感度相对高于 间接法
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亲和素-生物素-ELISA法
• 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4 个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。
• 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与 蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素 化的产物。
• 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性 强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。
• 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相 抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上 的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性 反应。
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捕获包被法测抗体
• 样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性 IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因 此测定IgM抗本多用捕获法。
• 先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特异 性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特 异性IgM。
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间接法的特点
• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染 病的诊断。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同 一酶标抗体检测相应抗体。
• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注 意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。 若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影 响包被效果。
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竞争法测抗原
• 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高 ELISA的敏感度。
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Leabharlann Baidu 双抗体夹心法测 抗原
双抗原夹心法测 抗体
间接法测抗体
适用于
是检测抗原最 常用的方法， 适用于检验各 种蛋白质等大 分子抗原
乙肝标志物中 抗HBs的检测常 采用本法
是检测抗体最常 用的方法,本法主 要用于对病原体 抗体的检测而进 行传染病的诊断
受检抗体，故称为间接法。
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☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相 抗原，洗涤。
（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固 相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育 洗涤。
（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合， 从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗 体的量。