Cryotop玻璃化冷冻人类卵裂期胚胎的临床应用_苏雁

二 、冷 冻 方 法
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江 苏 医 药 ２０１２ 年 ２ 月 第 ３８ 卷 第 ４ 期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ ３８，Ｎｏ．４
冷冻 前 仔 细 观 察 胚 胎，在 室 温 下 将 胚 胎 移 至 玻 璃 化 平 衡 液 （ＥＳ，ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ， Ｃｏｄｅ．ＶＴ１０１－０１，日本）中 平 衡 １０ｍｉｎ，然 后 转 移 至 玻 璃 化 冷 冻 液 （ＶＳ，ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ，Ｃｏｄｅ．ＶＴ１０１－０２，日本）中 平 衡，并 迅 速 把 胚 胎 放 到 Ｃｒｙｏｔｏｐ（ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｃｒｙｏｔｏｐ ｐａｃｋａｇｅ，日 本 ）的 前 端 ，并 迅 速 浸 入 液 氮 ，在 浸 入 液 氮 前 ，胚 胎 在 ＶＳ液体 内 的 时 间 控 制 在 ３０－６０ｓ，每 支 Ｃｒｙｏｔｏｐ 装 载 １－２ 个 胚 胎 。
结果 一 、胚 胎 复 苏 与 移 植 情 况 玻璃化法冷冻 复 苏 ５５ 个 周 期，共 １７２ 枚 胚 胎， 存活１４４ 枚，复 苏 率 为 ８３．７％；复 苏 后 培 养 １６ｈ 观 察，有３９ 个 周 期，共 ６９ 枚 胚 胎 继 续 发 育，表 现 出 良 好的发育潜 能。其 中 １ 个 周 期 因 胚 胎 复 苏 后 均 退 化，放弃 移 植，复 苏 周 期 共 移 植 １３３ 个 胚 胎，平 均 每 人 移 植 ２．４ 个 胚 胎 。 二 、临 床 妊 娠 情 况
玻 璃 化 法 冻 融 共 移 植 的 ５４ 个 周 期 中 ，临 床 妊 娠 ２４例、妊娠率 ４４．４％；其 中 单 胎 １３ 例、双 胎 １１ 例， 共着床 了 ３５ 个 胎 囊，种 植 率 为 ２６．３％；早 期 流 产 ３例，流产率１２．５％，５例足 月 分 娩 １０ 个 正 常 婴 儿， 其 余 １９ 例 继 续 妊 娠 。
讨论
卵裂早期胚胎的冷冻保存是胚胎冷冻生物学研 究 中 的 薄 弱 环 节 ，原 因 在 于 在 冷 冻 及 解 冻 过 程 中 ，会 产生一些有毒物质，这 些 物 质 的 存 在 会 影 响 胚 胎 的 继 续 发 育 ，文 献 报 道 其 毒 性 作 用 对 早 期 胚 胎 （如 ２ 细 胞 和 ４ 细 胞 期 ）发 育 的 影 响 大 于 晚 期 胚 胎 （如 ８ 细 胞 期 ）。 另 外 一 个 原 因 与 胚 胎 本 身 发 育 有 关 ，人 类 胚 胎 基因组的转录激活开始于胚胎的４细胞和８细胞时 期，普遍认为人类 ８ 细 胞 期 后 的 胚 胎 才 反 映 的 是 胚 胎的生理特性，而８ 细 胞 前 的 胚 胎 反 映 的 只 是 卵 子 的 生 理 特 性 。 在 合 子 型 基 因 激 活 （ｚｙｇｏｔｉｅ ｇｅｎｅ ａｃｔｉ－ ｖａｔｌｏｎ，ＺＧＡ）转变的过渡 阶 段，合 子 型 基 因 打 开，胚 胎从母型控制向合 子 型 控 制 转 换，这 一 过 程 细 胞 内 部很多机制正在建 立 和 转 换 之 中，处 于 此 特 殊 发 育 阶 段 ，对 冷 冻 非 常 敏 感 。
【关 键 词 】 玻 璃 化 冷 冻 ；人 卵 裂 期 胚 胎 【中 图 分 类 号 】 Ｒ７１１ 【文 献 标 识 码 】 Ａ 【文 章 编 号 】 ０２５３－３６８５（２０１２）０４－０４０９－０３
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｙｏｔｏｐ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｄａｙ ３ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ＳＵ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎｑｉａｎｇ，ＬＩ Ｘｉｕｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍａｔｅｒｎｉｔｙ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００４，ＣＨＩＮＡ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ＩＶＦ ｅｍｂｙｒｏｓ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｏｔｏｐ ｔｏｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｆｔｅｒ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎ ＩＶＦ ｃｙｃｌｅｓ，ｓｕｒｐｌｕｓ ｄａｙ ３ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｅｒｅ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｃｒｙｏｔｏｐ ｔｏｏｌｓ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｅｍｂｒｙｏｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｅｒｅ ｐｌｕｎｇｅｄ ｉｎｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｓｔｏｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｍｏｎｔｈｓ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｆｔｅｒ ｔｈａｗｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｏｆ １７２ｅｍｂｒｙｏｓ ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ５５ｐａｔｉｅｎｔｓ，１４４（８３．７％）ｓｕｒｖｉｖｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈａｗｉｎｇ．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １３３ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｆｏｒ ５４ ｗｏｍｅｎ，ｏｆ ｗｈｏｍ ２４ｐａｔｉｅｎｔｓ （４４．４％）ｇｏｔ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｐｒｅｇｎａｎｔ．Ｔｈｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ２４ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ（１２．５％）ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ．Ｆｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ １０ ｈｅａｌｔｈｙ ｂａｂｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ １９ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ ａｒｅ ｏｎｇｏｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｒｙｏｔｏｐ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｏｒｋｓ ｅｆｆｅｃｉｅｎｔｌｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｄａｙ ３ＩＶＦ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．
江 苏 医 药 ２０１２ 年 ２ 月 第 ３８ 卷 第 ４ 期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ ３８，Ｎｏ．４
Ｃｒｙｏｔｏｐ玻璃化冷冻人类卵裂期胚胎 的临床应用
· ４强 李秀玲 王 培 赵 静 凌秀凤
【摘要】 目的 探讨玻璃化冷冻技术 在 人 类 卵 裂 期 胚 胎 冷 冻 中 的 应 用 效 果 。 方 法 将 接 受 体 外受精－胚胎移植的患者第３天移植后剩余的胚胎进行 Ｃｒｙｏｔｏｐ玻璃化冷冻保存，液氮下 储 存 ３ 个 月 后，根据患者情况复苏胚胎，观察胚胎复苏后的临床妊娠效果。结果 玻 璃 化 冷 冻 复 苏 ５５ 个 周 期 共 １７２个胚胎，存活１４４个（８３．７％）。移植５４个周期共１３３个胚胎，临床 妊 娠 ２４ 个 周 期（４４．４％）。 其 中，３例流产（１２．５％），５例足月分娩１０个正常 新 生 儿，１９ 例 继 续 妊 娠。 结 论 Ｃｒｙｏｔｏｐ玻 璃 化 冷 冻 法 适 于 人 类 早 期 胚 胎 的 冷 冻 保 存 ，获 得 了 理 想 的 复 苏 率 、妊 娠 率 和 种 植 率 。
玻璃 化 冷 冻 最 大 优 点 是 无 冰 晶 的 形 成，从 而 对 胚胎的损伤降 到 最 低，整 个 过 程 耗 时 ２０ｍｉｎ 左 右， 操作简便，无需 昂 贵 的 设 备。 理 论 上 讲 玻 璃 化 冷 冻 由于避免细胞内外冰晶形成，减 少 一 系 列 物 理 及 化 学 损 伤 ，能 提 高 冻 融 后 胚 胎 存 活 率 。 但 到 目 前 为 止 ，关 于 人 类 卵 裂 早 期 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 相 关 的 报 道 很 少 。Ｅｌ－Ｄａｎａｓｏｕｒｉ等 用 ［１］ ＯＰＳ 法 玻 璃 化 冷 冻 保存了人类第 ３ 天 ６－８ 细 胞 期 胚 胎，冻 融 后 胚 胎 存 活率 为 ４９．３％，胚 胎 移 植 后 获 得 ３０．５％ 临 床 妊 娠 率。Ｒａｍａ等 用 ［２］ 玻 璃 化 法 冷 冻 了 人 类 第 ３ 天 ８ 细 胞胚胎，获 得 较 高 的 胚 胎 存 活 率 ９５．３％。Ｂａｌａｂａｎ 等 用 ［３］ Ｃｒｙｏｌｏｏｐ玻 璃 化 冷 冻 和 程 序 化 冷 冻 两 种 方 法 ，分 别 冷 冻 了 人 类 第 ３ 天 胚 胎 ，结 果 表 明 玻 璃 化 冻 融后第３天胚胎的 存 活 率 高 于 程 序 化 冷 冻，并 且 玻 璃化冷冻 组 胚 胎 丙 酮 酸 的 摄 取 明 显 高 于 程 序 化 冷 冻；８细胞 期之前丙酮酸为胚胎主要的能量来源，提 示 细 胞 代 谢 旺 盛 ；冻 融 后 胚 胎 继 续 培 养 ，提 示 囊 胚 形 成率也明显高于程序化冷冻。在国内卵裂期胚胎的 玻璃化冷 冻 还 处 于 临 床 应 用 的 起 步 阶 段。２００３ 年 中国华东科技大学同济医学院王俊霞等 应 ［６］ 用 麦 管 玻璃化技术冷冻人 类 卵 裂 期 胚 胎，获 得 国 内 首 例 妊 娠并顺利 分 娩。２００７ 年 安 徽 医 科 大 学 附 属 省 立 医 院生殖医学中心童先宏等 选 ［７］ 用受精后第３天 的 移
三 、胚 胎 复 苏 １．子宫内膜 的 准 备 采 用 自 然 周 期 或 口 服 戊 酸雌二 醇 准 备 子 宫 内 膜，卵 泡 破 裂 或 内 膜 厚 度 达 ８ｍｍ后，开始予黄体支持。给予黄体酮后第３ 天下 午复苏胚胎。 ２．胚 胎 的 复 苏 在 ３７℃ 下 ，将 Ｃｒｙｏｔｏｐ 从 液 氮 中 取 出 ，把 Ｃｒｙｏｔｏｐ的 前 端 立 即 浸 入３７℃ 的 解 冻 液 （ＴＳ，ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ Ｃｏｄｅ． ＶＴ１０２－０１，日 本 ）中 ，反 复 洗 涤 １ｍｉｎ；迅 速 将 胚 胎 转 移 到 稀 释 液 （ＤＳ，ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ Ｃｏｄｅ．ＶＴ１０２－０２，日本）中 平 衡 ３ ｍｉｎ，关 闭 恒 温 板 的 温 度 控 制 设 施 ；再 迅 速 将 胚 胎 转 移 到 洗 涤 液 １ （ＷＳ１， ＫＩＴＡＺＡＴＯ， Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ Ｃｏｄｅ． ＶＴ１０２－０３，日本）中 平 衡 ５ｍｉｎ；然 后 迅 速 将 胚 胎 转 移 到 洗 涤 液２（ＷＳ２，ＫＩＴＡＺＡＴＯ，Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫＩＴ Ｃｏｄｅ．ＶＴ１０２－０４，日 本）中，同 时 打 开 恒 温 板 的 温 度 控制设施，平衡５ｍｉｎ，最 后 移 入 培 养 液 中 培 养 等 待 移植。 冻 融 后 胚 胎 培 养 ２－４ｈ 后，在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 ，主 要 根 据 形 态 学 ，判 定 冷 冻 胚 胎 是 否 存 活 。 存 活 标 准 为 ：细 胞 膜 完 整 ，胞 质 折 光 性 好 ，透 明 带 完 整 ， ≥５０％ 以 上 的 卵 裂 球 存 活 。 ３．胚 胎 移 植 复 苏 后 １６ｈ 观 察 ，选 择 存 活 较 好 的２－３ 枚 胚 胎 进 行 移 植，移 植 后 常 规 黄 体 支 持， １０－１６ｄ测血清 ｈＣＧ，移 植 后 ３０－３６ｄ 超 声 检 查 见 孕 囊为临床妊娠。