单克隆抗体
单克隆抗体结合的原理
单克隆抗体结合的原理
单克隆抗体是一种由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特
异性和亲和力。
其结合原理是基于抗体与抗原之间的特异性相互作用。
抗原是一种能够诱导免疫系统产生抗体的分子，通常是一种蛋
白质或多肽。
而抗体则是由免疫系统产生的一种蛋白质，具有与抗
原特异性结合的能力。
单克隆抗体结合的原理可以简单概括为以下几个步骤：
1. 抗原识别，单克隆抗体通过其特异的抗原结合部位（paratope）识别并结合特定的抗原。
这种特异性是由抗体的可变
区域决定的，可变区域是由基因重组产生的，因此每个单克隆抗体
都具有特定的抗原结合特性。
2. 抗原结合，一旦抗体的可变区域与抗原结合，就会形成一个
稳定的抗原-抗体复合物。
这种结合是通过多种相互作用力（如氢键、离子键、疏水相互作用等）来实现的，从而确保抗体只与特定的抗
原结合。
3. 免疫应答，抗原-抗体复合物的形成会触发一系列免疫应答，
包括激活其他免疫细胞、促进抗原清除等，从而帮助机体对抗病原体或异常细胞。
单克隆抗体结合的原理不仅在基础免疫学研究中有重要应用，还在临床诊断、药物研发和治疗等领域发挥着关键作用。
通过了解单克隆抗体的结合原理，我们可以更好地理解免疫应答的机制，设计更有效的治疗策略，推动医学领域的发展和进步。
单克隆抗体技术医学PPT
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
（R<3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• （3）提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
（1）体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为 10～60μg／ ml。如果大量生产，费用较高。
• 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同 时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理：
• （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途 径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组 织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
单克隆抗体原理
单克隆抗体原理
单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其原理主要包括抗原诱导、B细胞克隆扩增、单克隆B细胞筛选和抗体生产等过程。
首先，抗原诱导是单克隆抗体形成的第一步。
当外源抗原进入机体后，能够激
活机体的免疫系统，包括B细胞。
B细胞表面的B细胞受体（BCR）能够与抗原
特异性结合，从而激活B细胞，促使其分化为浆细胞和记忆B细胞。
其次，B细胞克隆扩增是单克隆抗体形成的第二步。
在抗原的刺激下，激活的
B细胞会不断分裂增殖，形成大量的克隆B细胞。
这些克隆B细胞具有相同的抗
原特异性，但其抗体亲和力和效应功能可能存在差异。
接着，单克隆B细胞筛选是单克隆抗体形成的第三步。
在B细胞克隆扩增的
过程中，经过体内或体外的筛选，最终能够筛选出具有最高亲和力和特异性的单克隆B细胞。
这些单克隆B细胞将成为单克隆抗体的生产细胞。
最后，抗体生产是单克隆抗体形成的最后一步。
通过体外培养和诱导，单克隆
B细胞可以被转化为产生单克隆抗体的浆细胞。
这些浆细胞能够合成和分泌特异性
的单克隆抗体，从而实现对特定抗原的高效识别和结合。
总的来说，单克隆抗体的形成是一个经过精细调控的过程，涉及到抗原诱导、
B细胞克隆扩增、单克隆B细胞筛选和抗体生产等多个环节。
通过深入理解单克隆抗体的形成原理，可以为单克隆抗体的研发和应用提供理论依据和技术支持。
单克隆抗体的优点及应用
单克隆抗体的优点及应用单克隆抗体指的是在体外培养中由单个克隆细胞产生的抗体，具有以下优点：1. 高度特异性：单克隆抗体只能识别和结合特定的抗原，从而实现高度特异性的识别分析。
这种高度特异性使得单克隆抗体在医学诊断、生物学研究和治疗中具有重要作用。
2. 高度稳定性：单克隆抗体经过长时间体外培养定向生产，具有较高的稳定性和一致性。
相比多克隆抗体，单克隆抗体的生产工艺更加可控，能够规避批次间的变异性。
3. 丰富的供应来源：单克隆抗体可以通过体外培养细胞的方式进行生产，而不依赖于动物体内免疫。
因此，可以实现大规模、高效率的抗体生产，并且能够满足临床和科研的需求。
4. 可调控的亲和力：通过对单克隆抗体的序列进行修饰和工程化，可以实现对其亲和力的调节。
这使得单克隆抗体在不同应用中，如免疫检测、药物传送和治疗等方面具有更高的灵活性。
单克隆抗体在各个领域都有广泛的应用：1. 临床诊断：单克隆抗体可用于各种免疫检测和诊断方法中，如ELISA、免疫荧光、免疫组织化学等。
例如，单克隆抗体可以用于检测特定癌细胞标志物，帮助早期诊断癌症，并监测疾病治疗的疗效。
2. 疾病治疗：单克隆抗体可以作为治疗药物，用于疾病的预防和治疗。
例如，单克隆抗体可以用于免疫疗法，通过结合特定抗原靶点来激活免疫系统，以治疗疾病如癌症、风湿性关节炎等。
3. 药物研发：单克隆抗体可用于药物研发的多个环节。
首先，通过单克隆抗体的选择，可以筛选出特定靶点的抗体药物。
其次，单克隆抗体也可用于药物的毒性测试和临床试验的监测，为药物的研发提供重要的技术支持。
4. 生物学研究：单克隆抗体在生物学研究中具有广泛的应用。
例如，可以利用单克隆抗体来研究特定蛋白质的功能、表达和定位。
此外，还可以利用单克隆抗体进行细胞或组织样本的免疫荧光染色，以实现对细胞和组织结构的分析。
5. 农业和食品安全：单克隆抗体也可以应用于农业和食品安全领域。
例如，可以利用单克隆抗体来检测和监测农业有害生物，或者检测食品中存在的有害物质和污染物。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言单克隆抗体是一类由单个免疫细胞分泌的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它被广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其质量和效力的关键步骤之一。
本文将介绍单克隆抗体的鉴定方法和流程。
一、单克隆抗体的来源和制备单克隆抗体的制备通常分为两个阶段：免疫原注射和细胞融合。
免疫原注射是将特定抗原注射到动物体内，诱导免疫细胞产生特异性抗体。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞融合，形成可无限增殖的杂交瘤细胞。
二、鉴定单克隆抗体的特异性特异性是评估单克隆抗体质量的重要指标。
常用的鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过将抗原固定在微孔板上，然后加入单克隆抗体进行检测，来评估其特异性和亲和力。
三、鉴定单克隆抗体的亲和力亲和力是指抗体与抗原结合的强度。
常用的亲和力鉴定方法包括ELISA、流式细胞术和生物传感等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过变化抗原的浓度或稀释单克隆抗体的方式来评估其亲和力。
四、鉴定单克隆抗体的稳定性稳定性是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的稳定性鉴定方法包括温度稳定性、冻融稳定性和长期保存稳定性等。
其中，温度稳定性可以通过将单克隆抗体暴露在不同温度下，然后检测其活性的变化来评估。
五、鉴定单克隆抗体的纯度纯度是评估单克隆抗体质量的重要指标之一。
常用的纯度鉴定方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱和质谱等技术。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的方法之一，可以通过检测单克隆抗体与其他蛋白质的分离情况来评估其纯度。
六、鉴定单克隆抗体的交叉反应性交叉反应性是指单克隆抗体与非目标抗原结合的能力。
常用的交叉反应性鉴定方法包括ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术。
其中，ELISA是最常用的方法之一，可以通过将非目标抗原固定在微孔板上，然后加入单克隆抗体进行检测，来评估其交叉反应性。
七、鉴定单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用广泛，包括医学诊断、药物研发和治疗等领域。
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞（2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。
血清抗体与单克隆抗体的比较：名称产生特点血清抗体由B淋巴一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强，灵敏度高，能大量制备知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。
筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。
因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
相关高中生物知识点：植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术：1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
单克隆抗体
克隆化方法
经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一 般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞 有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤 细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所 以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性 强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、 软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
周期第1天采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清） 第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂） 第14天第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第21天采血和ELISA检测 第35天第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂） 第42天采血和ELISA检测 第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水） 第61天细胞融合
细胞融合
融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或 5:1最为常用。
1．试剂与材料 (1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。 (2)1640培养液100ml。 (3)完全1640液100ml。 (4)2.5%FCS－1640液50ml。 (5)HAT培养液100ml。 (6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热 于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。 (7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。 (8)40孔塑料培养盘。
单克隆抗体作用方式
单克隆抗体作用方式单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAbs）是由单一克隆细胞系分泌的抗体，能够特异性地结合到目标抗原，从而发挥诊断和治疗作用。
单克隆抗体的作用机制主要包括以下几个方面：1. 特异性识别和结合单克隆抗体与传统的多克隆抗体相比，具有更高的特异性和亲和力。
这是因为单克隆抗体是由同一种抗体基因克隆而来，因此它们具有相同的抗原识别性能和结合位点。
利用这种特性，单克隆抗体可以精确地识别和结合到目标抗原分子，而不会与其他非特异性分子发生结合。
2. 抗原特异性的中和单克隆抗体可以通过结合到目标抗原分子表面的关键位点，阻断其与细胞受体或其他配体的结合，从而抑制其生物学活性。
这种中和作用对于病毒和细菌等微生物的感染特别有效。
例如，针对新冠病毒的单克隆抗体已被证实可以中和病毒入侵人体细胞的过程，从而抑制病毒在体内的复制和传播。
3. 细胞毒性作用某些单克隆抗体可以结合到肿瘤细胞表面的特异性抗原上，激活免疫细胞进行攻击，从而发挥抗肿瘤作用。
例如，CD20单克隆抗体可以结合到B细胞表面的CD20抗原上，引导免疫细胞对B细胞进行杀伤。
4. 免疫调节作用单克隆抗体还可以通过结合到细胞表面的免疫调节分子（如PD-1、CTLA-4等），抑制其与配体的结合，从而调节免疫细胞的活性。
这种免疫调节作用已被广泛应用于肿瘤治疗和自身免疫性疾病治疗中。
例如，PD-1单克隆抗体可以阻断PD-1与PD-L1的结合，从而激活免疫细胞对肿瘤进行攻击。
单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力，能够通过多种机制发挥诊断和治疗作用。
随着单克隆抗体技术的不断发展，相信它们将在未来的生物医药领域中发挥越来越重要的作用。
单克隆抗体的分子量
单克隆抗体的分子量单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体分子量是指单克隆抗体分子的总质量，通常以千道尔顿（kDa）为单位。
本文将从单克隆抗体的定义、制备方法、应用领域以及分子量对于抗体的功能和稳定性的影响等方面进行探讨。
单克隆抗体是由一种特定的B细胞克隆产生的抗体，其与特定抗原结构的结合能力非常高。
制备单克隆抗体的关键步骤是融合B细胞和骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，这种细胞具有B细胞的抗体合成能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，从而实现了大规模单克隆抗体的制备。
单克隆抗体在医学、生物学和生物工程等领域具有广泛的应用。
在医学方面，单克隆抗体被用于诊断和治疗多种疾病，如肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
在生物学研究中，单克隆抗体被用于检测和分离目标分子，如蛋白质、细胞和病毒等。
在生物工程领域，单克隆抗体被用于生物药物的研发和生产，如单克隆抗体药物和诊断试剂盒等。
单克隆抗体的分子量对于其功能和稳定性具有重要影响。
通常情况下，单克隆抗体的分子量较大，一般在150 kDa左右。
较大的分子量使得单克隆抗体具有较长的半衰期，能够在体内稳定存在较长时间，从而延长了药物的效果。
此外，较大的分子量还有助于增加抗体的亲和力和特异性，提高其与抗原的结合能力。
然而，单克隆抗体的分子量过大也可能导致一些问题。
例如，较大的分子量可能限制抗体在组织和细胞内的渗透能力，降低其治疗效果。
此外，较大的分子量还可能增加抗体的免疫原性，引起患者的免疫反应。
因此，在设计和选择单克隆抗体时，需要综合考虑其分子量与其他因素之间的平衡。
单克隆抗体是一类具有高度特异性和亲和力的抗体，其分子量常常作为评估抗体性能的重要指标之一。
单克隆抗体的制备方法和应用领域多种多样，可以广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
抗体的分子量对于其功能和稳定性具有重要影响，需要在设计和选择抗体时进行综合考虑。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程随着生物技术的发展和应用的广泛，单克隆抗体作为一种重要的生物分子工具，在医学诊断、治疗和科学研究领域发挥着重要作用。
单克隆抗体是通过体外复制细胞免疫应答过程中产生的单一克隆抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
下面将简要介绍单克隆抗体的制备过程。
第一步：免疫原的选择制备单克隆抗体的第一步是选择适当的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂类等生物大分子，也可以是一种特定的细胞、细胞表面分子或化合物。
免疫原的选择应根据需要检测或研究的目标来确定。
第二步：免疫动物的选择和免疫过程为了制备单克隆抗体，需要选择适当的免疫动物。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
免疫过程分为初次免疫和加强免疫两个阶段。
初次免疫是将免疫原注入免疫动物体内，刺激机体产生免疫应答。
加强免疫是在初次免疫后再次注入免疫原，以增强机体的免疫应答。
第三步：细胞融合和杂交瘤的建立细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤。
它是将免疫动物体内产生的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
融合细胞的选择和优化是确保制备高效单克隆抗体的重要因素。
第四步：筛选和克隆单克隆抗体细胞融合细胞后，需要进行单克隆抗体细胞的筛选和克隆。
常用的筛选方法包括限稀稀释法、酶联免疫吸附试验等。
通过这些筛选方法可以筛选出产生目标抗体的单个细胞克隆。
第五步：单克隆抗体的生产和纯化筛选出单克隆抗体细胞后，需要进行大规模培养和生产。
单克隆抗体的生产可以通过体外培养细胞和动物体内生产两种方式进行。
体外生产是将单克隆抗体细胞培养在培养基中，利用生物反应器等设备进行大规模培养。
动物体内生产是将单克隆抗体细胞移植到合适的动物体内，利用动物自身的机制产生单克隆抗体。
之后，通过各种纯化方法，如蛋白A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，从培养物中纯化出单克隆抗体。
第六步：单克隆抗体的特性研究和应用制备得到的单克隆抗体需要进行进一步的特性研究和应用。
单克隆抗体
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 液氮储存器
是细胞培养室的必要设备。杂交瘤细胞需要在液氮储 存器中保存。
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 水浴恒温装臵
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 冰箱
各种培养用的溶液，如培养液、 生理盐水、消化液、血清等都要储 存在0度或更低的温度条件下，普 通冰箱是单克隆抗体制备的必需设 备。血清、酶、消化液和配制好的 抗生素等溶液，需要低温保存以防 失去活性。不同生物制品要求保存 温度不同，有的在保鲜温度（4 度），有的则必须低温保存。因此， 尚须配臵-20度以下的低温冰箱。
培养基
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• DMEM、RPMI-1640。
• 配制时干粉制剂搅拌全溶后，加水到需要 的体积。 • 除菌过滤分装。 • 使用前根据需要再加入适量的牛血清、抗 生素、碳酸氢钠、丙酮酸盐和谷氨酰胺等 成分。
血清
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 血清体外细胞培养中不可缺少的成分 。 • 牛血清分胎牛血清和小牛血清两种 。 • 实验前须对不同来源及批号的血清进行 筛选。 • 融合亲代细胞的培养一般采用含10％胎 牛血清培养基。但在融合、筛选及随后 的克隆中一般用含20％的胎牛血清培养 基。 • 根据需要在用前将胎牛血清灭活 。
B cell
-b -a
-c -d
脾 细 胞
传统抗体 (抗血清) 对 抗 原 的 反 应
细胞融合
PEG HAT -a -b Cell fusion
分株培养筛选
a b c d
+ + + +
-c
-d ELISA
名词解释单克隆抗体
名词解释单克隆抗体
单克隆抗体是一种由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它们与传统的多克隆抗体相比，具有更高的结构稳定性和一致性。
单克隆抗体通常由一个免疫细胞产生，这个细胞被称为“单克隆细胞”。
单克隆细胞可以通过融合技术（如融合瘤）或用单个免疫细胞克隆的方法得到。
单克隆抗体的制备过程主要包括免疫原诱导、细胞融合或单克隆细胞培养、抗体筛选和纯化等步骤。
相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有以下优势：
1. 高度特异性：单克隆抗体只由一个B细胞克隆产生，因此具有更高的特异性，可以识别并结合到目标分子的特定位点。
2. 结构一致性：由于单克隆抗体是从单个B细胞克隆而来，因此它们的抗体结构和序列非常一致，减少了批次间和批次内的变异性，有利于保证其质量和效果的一致性。
3. 更好的稳定性：单克隆抗体的结构稳定性较好，不易受外界环境的影响，因此更适合在各种条件下的应用，如药物研发、临床治疗等。
4. 无免疫原性：由于单克隆抗体是从人体内克隆得到的，因此不会引起免疫反应和过敏反应。
单克隆抗体在医学领域有着广泛的应用。
它们被广泛用于诊断、治疗和预防多种疾病。
临床上，单克隆抗体已经成功应用于治疗癌症、自身免疫性疾病、传染病等。
此外，单克隆抗体还可作为药物载体、诊断试剂和研究工具等。
总结起来，单克隆抗体具有高度特异性、结构一致性、稳定性和无免疫原性等优势，广泛应用于医药领域，为疾病的诊断和治疗提供了更精确和有效的手段。
单克隆抗体的结构
单克隆抗体的结构
单克隆抗体的结构可分为三个部分：Fab段、Fc段和可变区。
Fab段是单克隆抗体的抗原结合部位，由重链和轻链的V区组成，负责与抗原特异性结合。
Fc段则是单克隆抗体的效应功能区，由重链和轻链的C区组成，负责与效应细胞或补体结合，发挥调理吞噬、介导细胞毒杀伤等效应。
可变区位于重链和轻链靠近N端的1/5或1/4区域，是单克隆抗体的抗原结合特异性所在，由6个～7个氨基酸残基组成的环状结构，其氨基酸组成和排列顺序千变万化。
此外，单克隆抗体的重链和轻链之间通过二硫键连接，形成一个完整的球形结构。
在单克隆抗体的生产过程中，通过基因工程技术可以改变其可变区的氨基酸组成和排列顺序，从而获得具有不同抗原结合特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术是一种利用体外培养的细胞制备具有特定抗原识别能力的抗体的技术。
其原理可以分为以下几个步骤：
1. 免疫原注射：首先，将目标抗原注射到动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
2. B细胞分离：从免疫动物的脾脏或骨髓中获得淋巴细胞，然后利用细胞分离技术将B细胞单独分离出来。
3. 融合细胞的制备：将B细胞与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞系SP2/0或NS0）进行人工融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：在杂交瘤细胞培养基中加入选择性培养剂（如无氨杂喹或鸟嘌呤），促使非融合细胞死亡，同时使得杂交瘤细胞存活下来。
5. 细胞克隆：将单个杂交瘤细胞分离至各个孔中，分别培养，形成单个杂交克隆。
6. 抗原筛选：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或其他免疫学实验方法，对每个克隆进行筛选，选取对目标抗原具有高亲和力和特异性的克隆。
7. 抗体生产：根据所选取的克隆，将其注入小鼠腹腔或体外培养，以产生大量的单克隆抗体。
通过上述步骤，单克隆抗体技术可以制备出具有高亲和力、特异性和稳定性的单克隆抗体，用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
单克隆抗体在实验室的应用_概述说明
单克隆抗体在实验室的应用概述说明1. 引言1.1 概述单克隆抗体是一种重要的实验室工具，其应用广泛涉及生物学研究和医学领域。
本文将介绍单克隆抗体的定义、原理以及在实验室中的应用。
1.2 文章结构本文将分为五个主要部分进行描述和讨论。
第一部分是引言，对单克隆抗体的概述进行说明。
接下来，第二部分将详细介绍单克隆抗体的定义、历史发展以及制备原理和方法。
第三部分将探讨单克隆抗体在生物学研究中的应用，包括蛋白质检测和鉴定、细胞分析和流式细胞术以及基因工程和遗传学研究等方面。
第四部分将聚焦于单克隆抗体在医学领域中的应用，特别是药物研发与治疗、肿瘤治疗以及自身免疫性疾病治疗等方面的进展和展望。
最后，第五部分将总结单克隆抗体在实验室中的应用，并探讨其在科学研究和医学领域的未来前景。
1.3 目的本文的目的是通过对单克隆抗体在实验室中的应用进行概述，展示其在生物学研究和医学领域中的重要性和潜力。
我们希望读者能够全面了解单克隆抗体的定义、原理以及不同领域中的具体应用，并认识到其对于科学研究和疾病治疗所带来的巨大价值。
2. 单克隆抗体的定义和原理：2.1 单克隆抗体的概念和历史发展：单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，mAbs）是指由同一个淋巴细胞发生的单个B细胞分裂产生的一类完全相同的抗体分子。
在20世纪70年代初，科学家首次成功制备出单克隆抗体，这一技术革命性地改变了生物医学研究和临床诊断与治疗方法。
此后，单克隆抗体被广泛应用于实验室研究、药物开发和临床诊断等领域。
2.2 单克隆抗体的制备原理和方法：制备单克隆抗体主要包括以下步骤：首先通过免疫化学手段将特定的抗原注射到动物（如小鼠）体内，刺激其产生特异性的B细胞。
然后从动物脾脏或骨髓中收集这些B细胞，并将它们与特定类型的癌细胞（如患有多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)的癌细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有长期生存的特性，并能够持续产生与原始B细胞完全相同的单克隆抗体。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
单克隆抗体原理
单克隆抗体原理
单克隆抗体是由单一种细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其原理基于以下步骤：
1. 免疫原：首先，选择一个特定抗原作为免疫原，可以是细菌、病毒、蛋白质或人工合成的多肽等。
免疫原的选择很重要，需要具备良好的免疫原性和足够的抗原决定簇（epitope）。
2. 免疫反应：将免疫原注射到动物（如小鼠）体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
在注射的过程中，通常需要进行多次增强免疫，以提高免疫反应。
3. 脾细胞分离：在免疫反应结束后，从免疫动物的脾脏中获取免疫细胞。
这些免疫细胞中包含了多样性的抗体。
4. 融合：将免疫细胞与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具备细胞免疫的免疫记忆，同时也具备癌细胞的无限复制能力。
5. 屏幕筛选：杂交瘤细胞会产生大量抗体，但并非所有抗体都具有特异性和亲和力。
因此，需要通过筛选将那些特异性抗体单克隆化。
最常用的方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）或流
式细胞术。
6. 扩增和培养：经过筛选的单克隆细胞被分离并扩增，在体外培养中产生大量相同的单克隆抗体。
7. 纯化：最后，从培养物中纯化出单克隆抗体，以去除其他无关的蛋白质和污染物，获得高纯度的单克隆抗体。
单克隆抗体的原理以其高度特异性和亲和力为基础，为科学研究、临床诊断和治疗等领域提供了有力的工具。
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一、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法：
每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只
体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除
腹腔注射法
二、 单克隆抗体的纯化
可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法 （用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）
杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法(limiting dilution)
显微操作法(micromanipulation)
ELISA
ELISA
多头加样枪
三、 单克隆抗体的性质鉴定
Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体 40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot
(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO )
“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
第二节 单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤 细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
四、单克隆抗体的特性 （一）单克隆抗体的特性
高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性
（二）单克隆抗体的优点与局限性
优点 ： 在体外“永久”地存活并传代
用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗
体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围
McAb and PcAb
基因工程抗体（genetic engineering antibody)
杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白 质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人 抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成 分，保留原有的抗体特异性。
第一节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
反应强度不如多克隆抗体
制备技术复杂、费时费工、价格较高
McAb与PcAb的比较
McAb 可以不纯 高 高 低 无 高 PcAb 纯度高 低 低 高 有 低
抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本
McAb and PcAb
第三节 基因工程抗体制备
基因工程抗体(Genetic engineering antibody)
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第三临床医学院 临床检验教研室
王飞 副主任医师,副教授
教学目的：通过学习杂交瘤技术制备单克隆抗体的原 理和流程，熟悉单克隆抗体与基因工程抗体的制备技 术。 教学要求： 1、掌握单克隆抗体及基因工程抗体的概念。杂交瘤 技术的基本原理。 2、熟悉单克隆抗体的制备技术。基因工程抗体的技 术。 3、了解单克隆抗体的应用。
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody)
第二Байду номын сангаас抗体 单克隆抗体（monoclonal
antibody)
第三代抗体 基因工程抗体（genetic
engineering antibody)
多克隆抗体（polyclonal antibody)
大多数抗原分子具有多个抗原决定簇。一个抗
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的 主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺 乏，DNA合成的替代途径受阻
骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
SP2/O: HGPRT- ，TK-;
长命
脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化
增殖的杂交瘤 细胞系
单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
B淋巴细胞:寿命短,分 泌特异系性抗体
骨髓瘤细胞：寿命长
杂交瘤细胞：寿命长，
原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺 激机体产生多种抗体称为 多克隆抗体。
单克隆抗体（monoclonal antibody)
由一个只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生
的同源抗体称为单克隆抗体。 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部 位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度 高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是 研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂 诊断盒，治疗肿瘤，器官移植，自身免疫病等。
FACS法（fluorescence activated cell sorter）
软琼脂平板法(soft agar method)
有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高
实验室常用方法
方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液
单克隆抗体
一、杂交瘤技术
流 程
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞
膜易打开而有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA