单克隆抗体

McAb and PcAb
基因工程抗体（genetic engineering antibody)
杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白 质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人 抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成 分，保留原有的抗体特异性。
第一节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO )
“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
第二节 单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤 细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
反应强度不如多克隆抗体
制备技术复杂、费时费工、价格较高
McAb与PcAb的比较
McAb 可以不纯 高 高 低 无 高 PcAb 纯度高 低 低 高 有 低
抗原要求 得量 特异性 稳定 沉淀反应 成本
McAb and PcAb
第三节 基因工程抗体制备
基因工程抗体(Genetic engineering antibody)
杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法(limiting dilution)
显微操作法(micromanipulation)
原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺 激机体产生多种抗体称为 多克隆抗体。
单克隆抗体（monoclonal antibody)
由一个只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生
的同源抗体称为单克隆抗体。 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部 位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度 高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是 研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂 诊断盒，治疗肿瘤，器官移植，自身免疫病等。
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的 主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺 乏，DNA合成的替代途径受阻
骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
SP2/O: HGPRT- ，TK-;
长命
脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命
四、单克隆抗体的特性 （一）单克隆抗体的特性
高度特异性 高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 对环境敏感性
（二）单克隆抗体的优点与局限性
优点 ： 在体外“永久”地存活并传代
用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗
体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法 可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗 局限性 ： 固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围
ELISA
ELISA
多头加样枪
三、 单克隆抗体的性质鉴定
Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞 争抑制 法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K 杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体 40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条 McAb靶抗原分子量：常用western blot
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody)
第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal
antibody)
第三代抗体 基因工程抗体（genetic
engineering antibody)
多克隆抗体（polyclonal antibody)
大多数抗原分子具有多个抗原决定簇。一个抗
一、单克隆抗体的产生
动物体内诱生方法：
每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只
体外培养法： 中空纤维培养系统 单抗含量不高，牛血清Ab难以去除
腹腔注射法
二、Leabharlann Baidu单克隆抗体的纯化
可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法 （用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第三临床医学院 临床检验教研室
王飞 副主任医师,副教授
教学目的：通过学习杂交瘤技术制备单克隆抗体的原 理和流程，熟悉单克隆抗体与基因工程抗体的制备技 术。 教学要求： 1、掌握单克隆抗体及基因工程抗体的概念。杂交瘤 技术的基本原理。 2、熟悉单克隆抗体的制备技术。基因工程抗体的技 术。 3、了解单克隆抗体的应用。
单克隆抗体
一、杂交瘤技术
流 程
细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞
膜易打开而有助于细胞融合
作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA
FACS法（fluorescence activated cell sorter）
软琼脂平板法(soft agar method)
有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高
实验室常用方法
方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化
增殖的杂交瘤 细胞系
单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
B淋巴细胞:寿命短,分 泌特异系性抗体
骨髓瘤细胞：寿命长
杂交瘤细胞：寿命长，